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Factors Affecting the Sedimentation Rate
Elevating the ESR:
Inflammatory Diseases
Cytokine driven processes that elevate fibrinogen ie TB, Pneumonia, rheumatoid
arthritis
• Relative/Absolute Increase in Globulin Proteins
Loss of albumin ie nephrotic syndrome or increase in globulins ie multiple
myeloma
• Extensive Tissue Necrosis
Myocardial infarction, trauma, tumors
• Other Causes
Pregnancy (increase in fibrinogen, anemia), anemia, age, heparinized blood
•
Lowering the ESR:
• Increased Plasma Viscosity
Waldenstrom's macroglobulinemia
• Red Cell Number or Shape
Polycythemia vera, sickle cell disease
• Decreased Plasma Proteins
Hepatic necrosis, hypofibrinogenemia
• Others Causes
Trichinosis
• Range - The range of normal SRE is 0-15 mm/hr for men and 0-20
mm/hr for women. Many articles have detailed the elevation of the
ESR with age and some have suggested the formula of age divided by
2 for men and age plus 10 divided by 2 for women although this has
not been universally adopted.
• Utility - Although still widely used, the sedimentation rate has limited
use as a diagnostic test. It is useful for predicting prognosis in diseases
such as rheumatoid arthritis and Hodgkin's disease and it has utility as
a marker of treatment efficacy in many diseases such as rheumatoid
arthritis, the vasculitides, collagen vascular diseases, and septic
arthritis.
CRP (Proteina C reattiva)
• The C-reactive protein owes its name to the ability of this protein to
precipitate pneumococcal C-polysaccharide in the presence of calcium.
It was first discovered in 1930 by Tillet and Frances.
• a positive CRP may indicate any of a number of things:
• Rheumatoid arthritis
• Rheumatic fever
• Cancer
• Tubercolosis
• Pneumococcal pneumonia
• Myocardial infartion
• Systemic Lupus Erithematosus
• Positive CRP results also occur during the last half of pregnancy or
with the use of oral contraceptives.
CRP
Utility - Because the CRP is a direct measure of inflammation
and it is becoming easier and cheaper to do, there may be a
time the CRP supersedes the ESR (although the same was said
for the measure of plasma viscosity 10 years ago). It is as
useful as the ESR in most cases and more accurately reflects
the current level of inflammation.
PRINCIPALI MALATTIE AUTOIMMUNI
SISTEMICHE
INTERMEDIE
ORGANO-SPECIFICHE
LES
S. GOODPASTURE
T. HASHIMOTO
AR
LUPUS DISCOIDE
SCLERODERMIA
D. MIOSITE
CONNETTIVITE
MISTA
ADDISON IDIOPATICO
UVEITE FACOGENICA
CIRROSI B. PRIM.
GASTRITE ATROFICA
OFTALMIA SIMPATICA
DIABETE GIOVANILE
SCLEROSI MULTIPLA
IFERTILITA' MASCH.
M. DI SJOGREN
MIASTENIA GRAVE
S. PLURIENDOCRINE
AUTOIMMUNI
COLITE ULCEROSA
ANEMIA PERNICIOSA
Lupus eritematoso sistematico
 Appare nelle donne tra 13 e 40 anni. Rapporto maschiofemmina 1:10
 Caratterizzato da febbre, debolezza, artriti, disfunsioni
renali
 I pazienti producono autoanticorpi verso il DNA, istoni,
eritrociti, piastrine, leucociti, e fattori di coagulazione
del sangue
 Gli immunocomplessi depositati lungo le pareti dei vasi
sanguigni causano una ipersensibilità di tipo III,
originano danno endoteliale che da luogo alle reazioni
infiammatorie che generano vasculuiti e
glomerulonefriti
Esami di Routine e Lupus
Incremento della VES e dei livelli di PCR
Emocromo: Anemia (Sintomo Costante)
Leucopenia (Linfocitopenia)
Trombocitopenia
Alterazioni della coagulazione (Lupus Anticoagulante)
Esame Urine:
Albuminuria (Microalbuminuria)
Ematuria
Allo stato attuale la dimostrazione della
positività della ricerca di autoanticorpi antinucleo (ANA) o la presenza di anticorpi
anti-dsDNA o anti-Sm (uno degli antigeni
nucleari estraibili, ENA) costituiscono 2
degli 11 criteri utilizzati da anni per la
diagnosi di lupus eritematoso sistemico
In generale il protocollo diagnostico
iniziale, in pazienti sintomatici prevede
la rilevazione degli anticorpi antinucleo in IFI; il pattern di fluorescenza
nucleare o citoplasmatico determina la
scelta successiva, rappresentata dalla
ricerca di autoanticorpi diretti verso
uno o più specifici autoantigeni
intracellulari
UV light
Autoimmunity
Determinazione degli ANA: Tecnica IFI
Standardizzata con linee cellulari epiteliali (HEp-2)
(esprimono antigeni umani presenti in tutte le fasi del ciclo cellulare)
Ai fini diagnostici I titoli di 1:40 e di 1:160 sono considerati
come livelli decisionali: Titolo soglia 1:40 (alta sensibilità/bassa
specificità)
<1:40 negativo. (Anticorpi antinucleo a basso titolo 1:40 - 1:80 possono essere
presenti in soggetti sani, nelle gravide, in donne sopra i 40 anni, negli anziani)
>1:40 e <1:160 basso positivo (in assenza di sintomi specifici, il protocollo
diagnostico deve prevedere un monitoraggio in tempi successivi)
>/=1:160 sono da considerare comunque suggestivi di patologia
autoimmune.
Pattern omogeneo
Fluorescenza omogeneamente
diffusa a tutto il nucleo con
colorazione dei cromosomi
delle cellule in mitosi. Gli Ab
sono diretti contro
desossiribonucleoproteine,
istoni, dsDNA.
Pattern periferico
Forte fluorescenza alla
periferia del nucleo debole al
centro. Dovuta alla presenza di
autoanticorpi diretti contro
ds DNA o contro
desossiribonucleoproteine
IL test IFI viene utilizzato anche per la valutazione degli
anticorpi anti ds DNA questo test si fonda su una reazione a
carico del DNA mitocondriale a doppia elica contenuto nel
cinetoplasto di un emoflagellato non patogeno per l’uomo
(Crithidia luciliae)
Negativo
Positivo
Limitazioni di quest’approccio:
Alcuni ENA (anti-Ro/SSA ed anti-Jo1) possono dare risultati
falsamente negativi (ridotta espressione degli antigenibersaglio nelle cellule HEp-2; perdita e/o denaturazione degli
antigeni in fase di allestimento dei vetrini
Non univocità della modalità di refertazione
Dipendenza dell’affidabilità del dato dall’esperienza del
microscopista
Difficoltà di reperimento di sieri standard di riferimento
Gli anticorpi anti-DNA
Test EIA
DNA a singola elica (denaturato, ssDNA; determinanti
antigenici: zone ricche di G-C e A-T)
DNA nativo a doppia elica (dsDNA, epitopi localizzati
lungo lo scheletro glico-fosfato)
Metodica IFI (Crithidia luciliae),
DNA nativo a doppia elica
Gli anticorpi anti-ssDNA non hanno una buona associazione
con precisi quadri patologici. Gli anticorpi anti-dsDNA sono
altamente specifici per il LES (10° criterio diagnostico del LES)
AutoantigeniENA:
Ro/SS-A
La/SS-B
Sm
RNP
Topoisomerasi I (Scl-70)
Istidil-tRNA sintetasi (Jo-1)
Proteina B centromerica (CENP-B)
rRNP
Nucleosomi (cromatina)
In presenza di segni clinici di S. di Sjogren o di
Dermatomiosite/polimiosite possono
rappresentare il principale dato di laboratorio.
Protocolli diagnostici in alcune malattie Autoimmuni
LUPUS
ANA
Pattern omogeneo o
periferico ad alto titolo
Anti dsDNA
Positivo
ENA
anti-Sm (altri inutili)
AnticorpiAntifosfolipidi
Incostantemente presenti
e lupus Anticoagulante
Protocolli diagnostici di base in alcune malattie Autoimmuni
Sindrome di Sjogren
•IgG
•ANA
Incremento policlonale
20% dei casi negativi
80% dei casi positivi
80% granulare
20% omogeneo
Raramente Nucleolare
•Anti dsDNA
(Inutili)
•ENA
80% Ssa/Ro
70% SSb/La
Protocolli diagnostici di base in alcune malattie Autoimmuni
Polimiosite/Dermatomiosite
VES
Molto Elevata
Emocromo
Lieve anemia, Eosinofilia
ANA
Pattern granulare
Anti dsDNA
(Inutili)
ENA
15% dei casi positivo Jo1
CPK, LDH
Generalmente aumentate
Fattore Reumatoide
30% dei casi positivo
Antiphospholipid antibodies:
•
Can be present in 30% 0f SLE patients.
•
Antibodies directed against phosphorylated
polysaccharide esters of fatty acids
•
Include: lupus anticoagulant, b2-glycoprotein-I,
anti-prothrombin Abs, and anticardiolipin Ab.
•
False positive VDRL can be seen in 50% of
patients
•
aPL production can also be associated with:
Medications
Infections
Neoplasms (lymphoma)
ANCA
Anti-Neutrophil Cytoplasmic
Antibodies
ANCA:
• Abs directed against several proteins in
cytoplasm of neutrophils in sera of patients
with different Vascular Autoimmune disease
and Systemic Autoimmune Disease .
• Measured by indirect immunofluorescence.
• ELISA is used to detect specific Abs to
proteinase-3 , and myeloperoxidase (MPO)
ANCA Patterns:
1. Cytoplasmic ANCA (C-ANCA):
anti-proteinase -3
2. Perinuclear ANCA (p-ANCA):
anti- myeloperoxidase (MPO), but also
elastase and other proteins in the neutrophil
granules
3. Atypical Patterns:
Ab to elastase, cathepsin G, lactoferrin, etc.
Gli ANCA: patologie associate
Sono considerati i principali markers sierologici specifici delle vasculiti e
delle malattie infiammatorie croniche,con un’incidenza dell’85-90% nelle
prime e 20-70% nelle seconde ;
Vasculite : infiammazione e
necrosi dei vasi con conseguente
modificazione del lume vasale ed
alterazioni ischemiche dei tessuti
irrorati;
quella maggiormente
rappresentata è il Morbo di Wegener.
Malattie infiammatorie croniche
intestinali (MICI):
con questo termine si indicano :
- Rettocolice ulcerosa:
infiammazione del colon;
- Morbo di Crohn : distruzione
continua della parete
dell’intestino,specialmente
a carico del tenue.
Classificazione
 p-ANCA o ANCA perinucleari : reagiscono principalmente
con la mieloperossidasi (MPO) presente nei granuli αazzurrofili, dando una fluorescenza di tipo perinucleare ;
 c-ANCA o ANCA citoplasmatici : diretti contro la
proteinasi3 (PR3), dando una fluorescenza finemente
granulare e diffusa per il citoplasma ;
 x-ANCA o ANCA atipici :
- danno una fluorescenza sia citoplasmatica che nucleare
- si osservano nei soggetti affetti da MICI,ma hanno una
sensibilità sconosciuta e una specificità bassa.
C-ANCA (cytoplamsic-ANCA):
– Diffuse staining of neutrophil cytoplasm in
immunofluorescene.
– Recognizes PR3(Proteinase –3), a serine protease
in primary granules of neutrophils.
– Is seen in 85% (range 30-90%) of patients
with Wegeners Granulomatosis.
– Highly specific for WG (98%)
– Titer correlates with disease activity (in 60%
of cases) and severity.
P-ANCA:
• P-ANCA in the setting of vasculitis is Ab
against MPO.
• Vasculitidies associated with MPO include:
–
–
–
–
Microscopic Polyangiitis (45-80%)
Idiopathic Crescentic GN: (65%)
Churg Strauss: (60%)
PAN: (15%)
• Anti- MPO can also be due to medications:
PTU, hydralazine, minocycline, D-penicillamine.
• Atypical P-ANCA can be seen with: RA, SLE,
IBD, Chronic liver diseases.
Rheumatoid Arthritis
Laboratory Testing, Principals and
Guidelines
Rheumatoid Factor (RF)
Introduction:
• RF is an antibody directed against the FC
portion of IgG.
• RF was originally described by Waaler and
Rose in 1940
• The RF measured in laboratories is IgM
RF, but IgG & IgA RF have been
described.
Conditions Associated with
Positive RF:
I.


Healthy Individuals:
RF can be positive in up to 4% of young
and healthy individuals.
RF positivity is higher in elderly people
without rheumatic diseases (ranging from
3-25% in different studies).

RF titer in this setting is usually < 1:160
Conditions Associated with
Positive RF: …cont.
II. Rheumatic Disorders:
 Rheumatoid Arthritis:
 Sjogren’s syndrome:
 SLE:

*
26-90%*
75-95%
15-35%
Polymyositis/Dermatomyositis:
5-10%
Variable in different studies, depending on
severity of disease in the study population
Non-Rheumatic Diseases
associated with Positive RF
Anti-Cyclic Citrullinated Peptide:
• Target amino acid is citrulline, in filaggrin
molecule derived from human skin.
• Citrulline is a post-translationally modified
arginine residue.
• ELISA assay for anti-CCP may be useful in
early stages of polyarthritis. [1]
Anti-CCP
IgM RF
RF & anti-CCP
Sensitivity
56%
73%
48%
[1] Bas et al. Rheumatoloy (Oxford) 2003; 62: 870
Specificity
90%
82%
96%
Serum Electrophoresis
• Gel electrophoresis shows an increase in
the globulins especially gamma
(antibodies) and alpha-2-globulin
• There is often a decrease in albumin (7)
Complete Blood Count (CBC)
• WBC in the peripheral blood often
remained undisturbed
• RBC’s show a moderate normocytic
hypochromic anemia of chronic disease
• A decrease in serum iron is common, Total
Iron Binding Capacity (TIBC) and normal
iron stores (ferritin) are essentially normal
Creatinine Kinase (CK)
• Serum CK is decreased below normal in
>60% of RA patients. This is not to be
confused with the CKMB (Myocardial)
portion or CKMM (skeletal muscle)
enzymes that are often measured during a
MI or chronic muscular diseases (7)
Synovial Biopsy
• Synovial fluid has high WBC and low
viscosity, glucose is greatly diminished in
the synovium
• RF usually present
• Characteristic rheumatoid nodules to aide
in diagnosis
• Positive biopsy of subcutaneous
rheumatoid nodule and synovia
American Rheumatism
Association Diagnosis Criteria
Positive biopsy within diagnostic
guidelines: criteria consists of:
– Poor mucin clotting of synovial fluid (4)
– Characteristic histological changes in
synovium: mesothelial, macrophage, LE
cells
Testing non-indicative of RA
• Other routine serological quantitative testing is
normal. This group includes Calcium, Uric Acid,
Alkaline Phosphorus, Phosphorus, and
Antistreptolysin O titers
Diagnostica di
laboratorio nello
studio delle patologie
immunoallergiche
La diagnostica dell’ asma
bronchiale è costituita da:
• Anamnesi ed esame obiettivo
• Test specifici in vivo e in vitro
VALUTAZIONE
ANAMNESTICA
• Predisposizione familiare (atopia) o altre patologie
immunologiche;
• Attività lavorativa
• Abitudini di vita (sport, fumo, ambiente)
• Terapie in atto
• Stagionalità degli eventi allergici e modalità di
insorgenza
Le reazioni di ipersensibilità IgE
mediate determinano diversi tipi
sintomatologie
L’allergia costituisce l’aspetto patologico, che si traduce in
danno,con quadri clinici diversi secondo gli organi
interessati:
•
•
•
•
•
Rino-congiuntivite
Asma
Orticaria
Allergie intestinali
Shock anafilattico
I TEST UTILIZZATI SONO:
IN VIVO
Test cutanei
PRICK E PATCH TEST
IN VITRO
PRIST o IgE totali
RAST o IgE specifiche
DOSAGGIO IgE TOTALI
Soggetti normali,
IL RISCONTRO DI ELEVATI
LIVELLI DI IgE TOTALI NON
AUTORIZZA UNA DIAGNOSI
DI ALLERGIA, POICHE’
POSSONO ESSERE ANCHE
PRESENTI IN:
 Patologie Parassitarie
Connettiviti,
Infezioni batteriche
croniche
Malattie
Linfoproliferative
Sistema di classificazione e cut-off
relativi alla classe di IgE Specifiche
•
Elaborati in base alla curva standard e alla calibrazione, forniti in kU/L
Classe
kU/L
0
<0,35
Assente o non rilevabile
I
0,35-0,69
Basso
II
0,70-3,49
Moderato
III
3,50- 17,49
Elevato
IV
17,5-52,49
Molto elevato
V
52,5-99,99
Molto elevato
VI
>100
Molto elevato
DOSAGGIO MEDIATORI E CITOCHINE
- Mast
cellule
T-LINFOCITI
EOSINOFILI
T
IL-x
BASOFILO
EOS
ISTAMINA
PGs - LTs
ECP
Basophil
PBM
TRIPTASI
CHEMOCHINE
ANA: If the ANA is positive, the laboratory automatically performs
Extractable Nuclear Antigens (ENA) and Double Stranded DNA
Antibody (dsDNA) tests.
If the ANA is negative, one may still request the Autoimmune Screen
Panel II (Advanced) depending on the working diagnosis.
Once the ANA has tested positive there is no diagnostic benefit in
repeating this test.
Please remember that an ANA may also be positive in up to 5% of
normal young females and decisions to proceed with further testing
should always take into account overall clinical and laboratory
features.
Rheumatoid Factor (RF): This test can be used alone or along
with other diagnostic tests to identify specific
autoimmune/rheumatologic or even infectious and malignant
diseases.
The test identifies the presence of a RF (an antibody {G,A,or M})
directed specifically against the CH2/3 domain of IgG.
The titre may be relevant in some but not all conditions for
disease monitoring (eg infections such as Tb), but a positive
test is significant.
Serum electrophor
Autoimmune Screen Panel II C3, C4, CH50: These tests
Coombs (direct): If an
autoimmune/rheumatologic disease is
suspected to be causing hemolytic
anemia this test can check whether
antibodies are indeed bound to red
blood cells. This would indicate an
autoimmune condition as the cause of
the RBC destruction.
SPEP (Serum protein electrophoresis):
This test is used to monitor albumin
and globulin protein levels in a patient’s
blood. If an autoimmune/rheumatologic
disease is affecting these levels, the
test results may be out of the reference
range. Lower albumin levels may reflect
chronic illness, elevated acute phase
reactants infection or inflammation,
elevated gammaglobulins inflammation
and if a spike present, possible
gammopathy.
measure the levels of
complement proteins in a
patient’s blood. The C4(classical
pathway) and C3 (alternate) are
static measures of the serum
levels of these proteins, whereas
the CH50 is a functional assay
that correlates with the
complement cascade activity. If
the measured values are not
within the reference range, this
may be indicative of an
autoimmune/rheumatologic
disease with immune complex
deposition.
aPTT: This test is used to
measure how well the patient’s
blood is clotting. It may be
prolonged in association with
autoimmune/rheumatologic
disease and coagulopathies.
Crystal Screen Panel
Serum Iron, TIBC: These tests are ordered together to test for iron
levels and saturation in the patient’s blood. Serum iron tests the
amount of iron in the patient’s serum while TIBC tests how much
iron the patient’s transferrin plasma proteins can bind. An elevated
serum iron and increased saturation will be seen in
Hemochromatosis, which can be a cause of CPPD arthopathy
(pseudogout).
Serum Uric Acid: This test is used to detect the level of uric acid in the
patient’s blood. High levels of uric acid can lead to monosodium urate
crystal build up in joints which causes gout.
Ca, Phos, Mg: These tests measure the amount of these minerals in the
patient’s blood. Several crystal arthropathies may be associated with
abnormal levels of these minerals.
Immunodeficit
PATOLOGIA
IMMUNODEFICIENZE
Congenite
Acquisite
MECCANISMI
IMMUNITA' UMORALE
IMMUNITA' CELLULARE
L'immunodeficienza può essere secondaria
 perdita di proteine come si verifica nel caso di gravi ustioni, nelle enteropatie
proteino-disperdenti, nella sindrome nefrosica.
 Le malattie da virus e batteri sono spesso accompagnate da immunodeficienza
riguardante soprattutto i linfociti T.
L’esempio più tipico è l’infezione da HIV
Anche virus diversi dall’HIV alterano la responsività immunologica come il
virus del morbillo e l’HTLV-1.
lebbra lepromatosa
Infezione da Mycobacterium tubercolosis
Funghi o di parassiti come il plasmodio della malaria.
L'immunodeficienza secondaria al morbillo può durare oltre due mesi e causare
riattivazione tubercolare.
ALTRE IMMUNODEFICIENZE ACQUISITE
1.
l’immunodeficit può essere la complicanza di un
processo morboso
2.
l’immunodeficit può essere la conseguenza di una
terapia, in tal caso si parla di immunodeficienza
iatrogena.

la senescenza

La malnutrizione proteica e calorica

La carenza di oligo elementi

Le neoplasie,
L’immunodepressione iatrogena è
dovuta nella maggior parte dei casi a
terapie farmacologiche che uccidono o
inattivano funzionalmente i linfociti
Corticosteroidi,
Ciclosporina A
Radiazioni e farmaci inibitori della
proliferazione cellulare
METODI DIAGNOSTICI IN CASO DI SOSPETTO
IMMUNODEFICIT – PRIMO LIVELLO
•ESAME EMOCROMOCITOMETRICO CON
FORMULA (VALORI RELATIVI ED
ASSOLUTI DELLE SINGOLE CELLULE)
•ELETTROFORESI SIERICA
•DOSAGGIO DELLE IMMUNOGLOBULINE
(IgG, IgA E IgM)
•DOSAGGIO DEL COMPLEMENTO
•RICERCA DI AUTOANTICORPI NONORGANO SPECIFICI
Deficit Ig: What do we measure?
•
•
•
•
•
Protein levels
Immunoglobulin levels
Immunoglobulin subclasses
Specific functional antibody levels
Complement levels
Evaluating Lymphocyte Functionality by
Immunoglobulin and Antibody Levels
• Ig levels (preferably relative to serum albumen as a marker for loss)
– by RID, ELISA; low or elevated
• Existing titers
– Isohemagglutinins, anti A and B isoagglutinins, T independent B
cell response
– heteroagglutinins/heterolysins (srbc)
– bactericidal (E. coli).
• IgG responses to vaccines (Never live ones!)
– T-dependent: DTP (tetanus), poliomyelitis, Hib-conjugate
– T-independent (over 5 years of age): Pneumococcal or Hib
polysaccharide, typhoid Vi
What tests can we perform in cell
mediated immunodeficiences?
• Lymphocyte subset measurement
• Tests of cellular function
• Cytokine assays
By Presence/Absence/Counting
• Complete blood count and differential
– totals and distribution of types of cells
• Fluorescent activated cell sorter (FACS) for
subpopulation counts
– B lymphocytes: CD19 or CD20
– T cells: CD3 (T and NK); CD4 and CD8
– Phagocytic functional deficit
Flow cytometry results
In vitro Mitogenesis
• Leukocytes are
collected from blood.
• White cells are
cultured in wells of
microplates with
appropriate
stimulants.
In Vitro Proliferation Tests
Compared
MLR
StimulatorsX-Irradiated
Blastogenesis
Mitoge n
+
+
Re sponde rs
Re sponde rs
+
+
H3-Thymidine
H3-Thymidine
Nitroblue Tetrazolium Test
+
Cells w ith
Intracellular
Reduced Dye
• neutrophils
• tests phagocytosis, and dye reduction during superoxide
production