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Research Meeting
R4 김경원
2004년도 현재 연구 상황
Micropapillary carcinoma of thyroid
Clinical and pathological review
Braf V599E mutation analysis
Role of H2O2 generation and its effect of
thyroid hormone synthesis and damage of
thyrocyte
TSH에 의한 catalase, GPx, PRx 변화
TSH에 의한 H2O2 생산의 변화
Proliferation of thyroid cell
 TSH mediated, cAMP-dependent PKA
 In WRT (Winstar rat thyroid) cell,
microinjection of PKA inhibitor partially
inhibited TSH induced DNA synthesis
 TSH mediated, cAMP-independent PKA
 TSH mediated, cAMP-dependent MAPK
(small G-protein Rap1, and B-Raf are
involved)
Molecular Pharmacology 2001, 60 (5)
Mitogen-Activated Protein Kinase
Raf protein and cancer
30% of human tumor : mutations in one of
the 3 Ras genes (KRAS>> NRAS, HRAS)
KRAS : ↑ level of Ras.GTP  active ERKs
pancreas adenocarcinoma, colon ca,
lung adenocarcinoma
In mammals : A-raf, B-raf, raf-1(c-raf, c-raf1)
 No RAF1 mutation were detected in
cancer cell lime (Davies et al. Nature 417(2002) 949-954)
Biochimica et Biophysica Acta 2003, 1653,25-40
Raf proteins and cancer
 BRAF gene mutation :
 melanoma (75%), colon cancer (15%)
 may not be actual cause of the cancer
 Prerequisite for development of tumor
 Cancer studies identified B-Raf rather than Raf-1
as more important of the Raf proteins for
mediating Ras effects and for activating
MEK/ERK
 BRAF and KRAS are equivalent in their
tumourigenic effects
Biochimica et Biophysica Acta 2003, 1653,25-40
B-RAF
B-Raf : highly restricted expression in
neuronal tissue, other in the testis, spleen
BRAF gene mutation
 melanoma (70%), colon cancer (15%), ovarian
cancer, thyroid cancer
 most frequent site 599 : Val(V)  Glu (E)
 ↑kinase activity in vitro
 Induce constitutive activation of ERK
 G1/S transition of the cell cycle through
regulation of the expression of cyclin D and E
Micropapillary thyroid cancer
갑상선 암 조직
파라핀 고정 조직의 사용이 가능한 환자
방법 : DNA extraction (QIAGEN®)and PCR
B-RAF V599E 돌연변이 분석 후 이와 임상
결과와 비교 예정
Micropapillary thyroid cancer
대상
1970년 부터 2004년
서울대병원, 분당 서울대 병원, 보라매병원에서 수술 받은
환자
의무기록 리뷰를 통한 후향적 연구
병리학적 소견과 임상 소견 (진단 시 연령, 성별, 경과) 분석
100명 구축 (200 명 예정)
Sample :
 갑상선 암 frozen tissue : 20여개 (SNUBH)
 파라핀 고정 조직 : 100 명 (SNU)
Tissue Array
갑상선 조직 : BRMH & SNUH
 Normal, adenoma, PTC, PMC, FC, AC, HT
Tissue array 제작, immunohistochemistry
Screening
 PTC vs PMC
 Follicular Carcinoma vs Adenoma
2004년도 현재 연구 상황
Micropapillary carcinoma of thyroid
Clinical and pathological review
Braf V599E mutation analysis
Role of H2O2 generation and its effect of
thyroid hormone synthesis and damage of
thyrocyte
TSH에 의한 catalase, GPx, PRx 변화
TSH에 의한 H2O2 생산의 변화
Thyroid hormone synthesis
Thyroid hormone synthesis
H2O2
Produced by a Ca 2+ dependent NADPH
oxidase
Electron acceptor in the TPO-catalyzed
iodination of thyroglobulin
Key control point in hormonogenesis
Potent inducers of apoptosis
Degradation of H2O2
In FRTL-5 cells, TSH increase the
exogenous H2O2 degradation rate (nmol/mg
DNA) (Björkman et al. Molecular and Cellular Endocrinology
111(1995))
GPx is involved in the low H2O2 (100umol/L)
Catalase is required at high H2O2 (mmol/L)
Eur J Endocrinology 2004, 150,841-849
Degradation of H2O2
 2 GPx in thyroid tissue, active in cytosol
Cytosolic GPx(GPx 1)
phospholipid hydroperoxide GPx(GPx 4)
More important than catalase
 단기간에 많이 생성된 H2O2 를 제거하는 데는 불충분
 Se deficiency  necrosis and fibrosis of thyroid gl
 Catalase enclosed in the peroxisomes
Not directly accessible at the site of H2O2 production
 Peroxiredoxin
Eur J Endocrinology 2004, 150,841-849
Role of Peroxiredoxin
Prx I :
 expression is stimulated by TSH and H2O2 and
MMI (Kim et al. J Biol Chem 2000,275, 18266-18270)
 thyroid tumor (Cancer Lett. 1999 Oct 18;145(1-2):127-32)
Prx II :
 also called TSA (thiol specific antioxidant)
 expression is NOT stimulated by TSH and
H2O2 and MMI (Kim et al. J Biol Chem 2000,275, 1826618270)
TSH regulate TSA mRNA (Kim et al. Cell Physiol
Biochem 2001,11, 247-252)
 may eliminate cytosolic H2O2 in resting and
TSH-stimulated thyroid cell ?
Autoimmune Thyroid disease
다른 기관에 생기는 자가면역질환은 세포
파괴나 기능저하와 관련
그레이브스병은 TSH receptor antibody를
통한 갑상선 기능 항진증을 유발
자가항체가 많이 생기는 이유가 혹시 H2O2
를 많이 생성하는 것과 관련이 있을 가능성
은?
연구 내용 및 방법
갑상선 세포에서 H2O2 생성 측정법
 Amplex Red H2O2 Assay kit
 Fluorometer using DCHF
갑상선 자극 호르몬 양에 따른 H2O2 제거
효소 변화 관찰
TSH를 제거한 5H , F12배지에서 FRTL-5 cell를
키운 후 Prx 양을 측정 (Western blot)
TSH deficient media에서 다시 TSH 를 공급하였
을 때 시간에 따른 Prx의 변화
2’7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCHF-DA)
esterase
Cell
2’7’-dichlorofluorescein (DCF)
H2O2, OH-
2’7’-dichlorofluorescein (DCF)
Cell preparation for H2O2
FRTL-5 cell
Cells were shift to 5H5 media, after
incubation in this medium, TSH were
added
Incubated in Krebs-Ringer solution +
DCHF-DA
Cell preparation for Prx
5H5
0
5H5
5H5
5H5
5H5
F12
5H5
5H5
F12
5H5
5H5
5H5
5H5
5H5
F12
6H5
6H5
6H5
5H5
5H5
F12
TSH
TSH
TSH
3
6
7.5
8
8.5
9
days
Western Blotting
Cell lysis
Concentration 측정 (BCA, microplate)
Cell sample preparation
Electrophoresis
Membrane Transfer
Primary antibody (1:3000- 1:6000) incubation
Exposure
Western Blotting
Prx I
Actin
5H 6d 5H6d 5H6d 5H6d 5H6d 5H6d 5H6d 5H6d 5H6d
F12 F12
F12 F12 F12 F12 F12
F12
6H0.5 6H1d 6H1.5 5H1.5 TSH0.5 TSH1.0TSH1.5
Western Blotting
Prx I
Actin
5H 6d
5H6d
F12
5H6d 5H6d
F12
F12
6H0.5 6H1d
5H6d 5H6d 5H6d
F12
F12
F12
6H1.5 5H1.5 TSH0.5
갑상선 세포의 성장 신호 전달 체계
IGF-1/insulin
Cytokine
JAK
Shc
P
P
IRS
AC
P
STAT
JAK/STAT
TSH/TSAb
s 
cAMP
Ras/MAPK
PI3K
PKA
q 
PLC
IP3+DAG
PKC
Cellular Growth & Proliferation
Relative DNA synthesis
성장인자에 따른 갑상선세포에 미치는 영향
1st incub.
2nd incub.
Control TSH IGF-1 EGF Insulin
* Immunoblotting : anti-Shc
0
0
0
TSH
0
TSH IGF-1
IGF-1 IGF-1 TSH
• TSH에 의해 변화된 세포 내 물질의 시간에 따른 변화 (preconditioning)
는 다른 성장인자에 의한 세포 증식 조절에 매우 중요한 역할을 담당
• TSH 및 여러 성장인자 자극 후 세포내 물질의 변화는 성장 인자에 따른
다양한 반응 양상을 설명 가능
AC Gs
cAMP, PKA
STAT3
Cyclin D1
Bcl xL
ICAM-1
VEGF
PI3K
p85 p110
PDK-1
TSH Receptor
mTOR
S6K1
rapamycin
S6
Thyrocyte proliferation
Regulation of follicle activity
Akt/PKB
Tumor
Suppressor
(p53, MDM2)
 TSH 수용체 성장신호전달 체계에서 중요한 역할을 담당하는 S6K1을
S6K1 특이-억제제인 rapamycin을 이용하여 억제한 후 유전자의 변화를
살펴봄으로써, S6K1의 주요 하부 신호 전달 체계를 규명
 이상의 microarray를 이용한 유전자의 발현 양상의 비교 분석은 갑상선
세포 성장기전 연구의 방향 설정에 중요한 정보를 제공할 것으로 기대됨
연구 목적
1) FRTL-5 갑상선 세포에서 TSH 자극 후 시간에 따른
2) TSH, IGF-1, insulin 등 성장 인자의 종류에 따른
3) 갑상선 세포에서 TSH 자극에 의한 중요한 성장신호전달
체계인 S6K1 활성 유무에 따른
갑상선 세포의 유전자 발현 양상의 변화를 살펴봄으로써,
갑상선 세포의 증식조절기전의 연구의 방향을 제시하고, 궁
극적으로는 갑상선종의 발생 기전 연구의 토대를 마련하고
자함
실험 방법
 세포 : normal rat thyroid cell-line (FRTL-5 cell)
 세포배양조건 : 6H5 - 5H5 - 3H0.5 o/n - 3H0.5 + 조건
 control 조건 : 3H0.5
 실험 조건
 TSH 자극 시간 변화 : 6, 24, 48, 72h (x3)
 성장인자 종류 : TSH, IGF-1, insulin, 24h (x2)
 S6K1 억제 : Rapamycin, TSH+Rapa, TSH, 6h (x2)
RNA 준비 : 연구자
cDNA chip 실험 : 인간유전체연구소
자료분석 : 인간유전체연구소
1월
2월
3월
4월
5월
6월
Normalization, Transformation &
Identification of Differential Expressed Gene
(DEG)
TSH 처리시간에 따른
유전자 발현의 분포 및 변화 경향 분석
Gene (DEG)
Up
number
12h ∩ 24h
24h ∩ 48h
1
7
3
14
difference
Down
number
difference
• 12h vs. 24h : 서로 다른 종류의 유전자 발현
• 24h vs. 48h : 비슷한 유전자 발현 양상
(24h에서 DEG는 48h에서도 모두 DEG)
발현 정도는 시간에 따라 감소
12
h
24
h
48
h
Up
11
7
45
Down
22
14
28
TSH 처리시간에 따라 발현하는 유전자 규명
및 그 변화 양상과 상호 관계 분석
Gene (DEG)
 Casein kinase 1 gamma 3 isoform
 Chondrotin sulfaye proteoglycan 6 etc
 ??? (unknown gene)
Up




1



Regulator of G-protein signaling 8
Similar to phosphoprotein enriched astrocytes 15
Rab 38, cyclin G1, MAP kinase 14
casein kinase 1 gamma 3 isoform, IFNg inducible protein
Nestin, NF kappa B p105 subunit, syntenin, etc
Aggrecan 1, myosin iE, p21-activated kinase 1
BMP 4, BMP receptor type 1A, etc
 Cyclin dependent kinase-4
Down





MAP kinase-activated protein kinase2, PIPPin protein
fatty acid binding protein 4, GABA transporter protein
Nucleoside phophorylase, splicing factor VT521-B, etc
CD151, cytochrome oxidase subunit Vic
Homeo box, msh-like 1
12h
24h
48h
향후 계획
 분석 완료 후, 통계적으로 의미 있는 발현 변화를 보인 유전자
의 identification
 유전자 발현 변화 확인 실험 : RT-PCR, Southern blot 등
 발현의 변화가 확인된 유전자의 functional assay, 상호관계 분
석
 갑상선 세포 증식 기전 연구의 중심 item 설정
 TSH의 작용 기전과 다른 성장인자들과의 상호작용에 따른 갑
상선 세포의 증식 기전 연구의 방향 설정