Download ppt - med.muni

Genová terapie a jiné terapeutické
molekulárně genetické přístupy
• Rekombinantní proteiny a „genetically engineered“
vakcíny
• Expresním klonováním produktů normálního genu
(klonované geny jsou exprimovány v mikroorganismech
nebo transgenních livestock), které slouží k tvorbě
velkých množství medicínsky cenných produktů
• Produkcí geneticky „engineering“ protilátek (geny pro
protilátky jsou manipulovány k tvorbě nových částečně
nebo plně humanizovaných protilátek) pro terapeutické
použití
• Produkcí „genetically engineered“ vakcín-především
proti tumorům a infekčním agens.
Genová terapie: typy
nemocí
•
•
•
•
Infekční nemoci
Rakoviny
Vrozené nemoci
Nemoci imunitního systému
Genová terapie
• Zahrnuje jakoukoliv proceduru, určenou k léčení
nemoci genetickou modifikací buněk pacienta.
• Do buněk se transferují: geny nebo jejich části
nebo oligonukleotidy.
• Genová terapie in vivo: transfer přímo do buněk
pacienta
• Genová terapie in vitro: genové modifikace
probíhají mimo organismus
• Genová terapie ex vivo: modifikované buňky se
vracejí do organismu
Genová terapie
• Klasická genetická terapie (dopravit
geny do vhodných cílových buněk, aby
bylo dosaženo optimální exprese
vnesených genů) s cílem:
• 1. zajistit produkci látky, která chybí
• 2. aktivovat buňky imunitního systému ve
snaze pomoci odstranit nemocné buňky
Neklasická genová terapie
• Inhibice exprese genů asociovaných s
patogenezou
• Korekce genetického defektu a obnovení
normální genové exprese
• Současná genová terapie se omezuje na
terapii somatických mutací. Etické
problémy s potenciální terapií
zárodečných mutací.
Rekombinantní
léky
je
možno
produkovat expresním klonováním v
mikroorganismech nebo v transgenních
zvířatech
• V mikroorganismech:
• Výhody: dostatečná množství produkovaných látek
• Nevýhoda: Pozměněné produkty v důsledku odlišných
posttranslačních úprav bílkovin se stejnou primární
strukturou (glykosylace)
problémy s purifikací
• V transgenních zvířatech: možnost navodit podobné
posttranslační systémy jako u člověka
„Genetically engineered“ protilátky
a vakcíny
• Uměle produkované terapeutické protilátky jsou
navrženy jako monospecifické (poznají jen jeden typ
antigenního místa) a poznají specifické antigeny
asociované s nemocí, což vede k zabití nemocných
buněk
• Typy nemocí:
• Lymfomy, leukemie, infekční nemoci, autoimunitní
nemoci.
• Hybridomy = heterogenní směs hybridních buněk
(vzniklých fúzí), které jsou schopny produkovat
specifické protilátky (B lymfocyty imunizovaného
zvířete) a přitom se v kultuře neomezeně dělit
(nesmrtelný myší B-lymfocytární tumor).
Chimerické a humanizované
protilátky
• Rekombinantní protilátky humánní-hlodavčí
• Humanizace hlodavčích mAb umožňuje získat
velké množství protilátek a zároveň zabránit
imunitní odpovědi lidského příjemce:
• chimerické V/C protilátky)
• CDR (complementarity determining regions)
graft protilátky
• Infekční patogeny a antigeny nádorových buněk
Plně lidské protilátky
• Technologie fágového displaye: protilátky jsou
tvořeny in vitro napodobováním selekční
strategie imunitního systému
• Transgenní myši: Transfer kvysinkových
umělých chromozomů s velkými segmenty
lidských těžkých a lehkých Ig řetězců do myších
embryonálních buněk. Narozené myši obsahují
velmi pozoruhodnou porci lidských V
genetických segmentů a jsou schopny tvořit
lidské protilátky
„Geneticky enginnered“ vakcíny
• Pomocí rekombinantní technologie:
• Vakcíny nukleových kyselin:
• bakteriální plasmidy s geny pro patogeny
nebo tumorové antigeny, podávané i.m. v
solném roztoku. Obsahují silný virový
promotor.
• „gene gun“ - zlaté perly, do nichž byla
precipitována DNA
„Geneticky enginnered“ vakcíny
• Genetická modifikace antigenu – např.
fúze cytokinu s antigenem ke zvýšení
antigenicity
• Genetická modifikace virů- virové vektory
• Genetické modifikace mikroorganismů,
které způsobí:
• odstranění genů nutných pro patogenezu
• expresi exogenního genu v bakteriích
nebo parazitech po jeho inzerci do těchto
organismů
Technologie klasické genetické
terapie
• Jedná se o zacílení buněk nemocné tkáně
• Geny mohou inzertovány do buněk
pacienta přímo a nepřímo
• Inzertované geny se mohou
• Integrovat do chromozomů
• Zůstat extrachromozomálně (epizomy)
Technologie klasické genetické
terapie
• Metody k zacílení nepostižených buněk:
• Buněčné zabíjení, způsobené imunitním
systémem- jde o podporu imunitní
odpovědi namířené proti nádorovým
buňkám nebo infekčním agens
• Uvolnění genetických produktů z buněk na
vzdáleném místě (myoblasty sekretují do
krve)
Genetický transfer
• Ex vivo
• Transfer klonovaných genů do buněk v
kultuře (transplantace autologních
geneticky modifikovaných buněk)
• In vivo
• Transfer se děje přímo do tkáně pacienta.
Pomocí liposomů nebo virových vektorů.
Principy genetického transferu
• cDNA s kompletní DNA kódující sekvencí je
modifikována k zajištění vysoké hladiny exprese, např.
pomocí silného virového vektoru. Následná inzerce
genu se děje
• A) do chromozomu
• gen se bude rozšiřovat do dalších buněk
• zajištěna vysoká úroveň exprese (kmenové buňky)
• náhodná inzerce-různá lokalizace –různá úroveň
exprese-smrt jednotlivé buňky-rakovina (aaktivace
onkogenu, deaktivace supresorového nebo
apoptotického genu-výhoda transferu ex vivo.
• B) extrachromozomálně – nevýhoda nejistého
dlouhodobého účinku
Haplotypes I and II within the genes encoding (a) interferon
(IFNG) and (b) interleukin 4 (IL4)
Relationship between IFNG genotype and IFN- expression levela
Potential scenario for the implementation of cytokine genetics in
future strategies for the treatment of multifactorial diseases
Schematic diagram of Ad5 virion. The double-stranded DNA genome is
packaged within an icosahedral protein capsid. The major structural protein
of the capsid is the hexon. Penton capsomers, formed by
association of the penton base and fiber, are localized at each of the
12 vertices of the Ad capsid.
The pathway of adenoviral infection
Retargeting of adenoviral vectors by bispecific conjugates.
(A) Ad attachment to cells is accomplished by the high affinity binding of the knob
(B) domain of the fiber to the primary cellular receptor, CAR.
(C) (B) The bispecific conjugate is designed to simultaneously ablate
(D) native tropism, by preventing the Ad vector from binding to CAR, and introduce
(E) novel tropism, by directing the vector to a novel target receptor on the cell surface.
Schematic diagram of fiber-pseudotyped vector.
The fiber-pseudotyped vector is constructed by substituting
the fibers from an Ad2 or Ad5 vector backbone with the fiber
proteins from an alternative serotype.
Scheme of HLA-restricted immune
response against cancer.
Peptide-loaded mature dendritic cells
can prime naïve T cells, which become
activated effector cells able
to recognize and kill
tumor cells expressing
the peptide/MHC complex.
Tumor cells and regulatory T cells
(the latter characterized by the
co-expression of
CD25 and CD4) can
produce immunosuppressive
factors that may inhibit both
the maturation of dendritic cells,
and the activation of T cells
Interaction between innate immunity cells
(NK cells, macrophages) and
HLA-restricted immunity against tumor.
NK cells can facilitate adaptive immune
response by increasing the availability
of TAA and danger signal mediators in
the tumor microenvironment, thus
favoring dendritic cell maturation.
This would lead to enhanced priming
of T cells, which ultimately
sustains an effective HLA-restricted
immune attack against cancer cells.
NK cell activity can be impaired by ROS,
which are produced by macrophages
present in the tumor microenvironment.
Some substances (e.g. histamine and IL-10)
inhibit ROS production by macrophages,
thus stimulating NK cell function.
Specific pathophysiology of a gene therapy side effect
Factors that regulate acute secretion of insulin from cells
Antisense therapeutics in cancer trials
Figure
1.
Schematic
representation
of
transcriptionally targeted gene expression. Tissue- or
cancer-specific
promoter-driven
reporter
or
therapeutic gene is incorporated into a gene delivery
vector (depicted as recombinant adenovirus here).
Gene transfer can occur in both targeted cancer cells
and non-targeted normal cells. However, transgene
expression can only occur in cancer cells due to the
presence of transcription factors competent to
mediate expression of the specific promoter. Red
squares denote the endogenous gene product
expressed from the specific promoter. The swirls
denote the reporter/therapeutic gene product.
Figure 2. Binary approaches to amplify activity of weak
promoter. (a) Two-step transcriptional amplification.
The specific promoter drives expression of a synthetic
transcriptional activator, GAL4-VP16, which in turn
binds to and activates the GAL4 responsive promoter
of the reporter or therapeutic gene. Multiple GAL4VP16 activators work in concert to synergistically
activate transcription of the downstream gene
(denoted by upward sweeping arrow). (b) Cremediated activation of gene expression. Cre
recombinase expression is regulated by a tissue- or
cancer-specific promoter. Activation of transgene
expression is induced by removal of the translational
inhibition sequence via a Cre-specific recombination
between
the
two
loxP
sites.
Figure 3. Estimation of the sensitivity of optical
imaging. Prostate cancer cells, LNCaP, were infected
by recombinant adenovirus expressing FL driven by
CMV promoter (AdCMV-FL) at MOI 10. Two days after
infection, cells were harvested and resuspended in
50 l sterile phosphate-buffered saline+50 l Matrigel
(BD Biosciences), and injected intra-peritoneally. On
the same day of cell implantation, mice were imaged
in Xenogen IVIS charged coupled device camera after
administration of 200
l D-luciferin substrate (15
mg/ml). Optical signal intensity (listed below images in
relative luminescent units per min of acquisition,
RLU/min) is roughly proportional to the number of
AdCMV-FL-infected cells (listed above the images).
The negative control cells were infected with AdCMVTK.
Figure 4. Verification of positive optical signals. Animals
bearing prostate tumor received 3.6 or 7.2×107
infectious units of prostate-targeted adenovirus, AdPSEBC-FL, administered via the tail vein. (a) Histological
analysis to assess positive signal. Twelve days after
administration, an optical signal was observed in the
lung (left panel) of an animal that received 3.6×107
infectious units of virus. The positive optical signal in this
animal was correlated with the presence of metastatic
human cancer cells in the lung (right panel). Cancer
cells in the lung sections were visualized by confocal
microscopy using CY-3 conjugated (red) human-specific
pan-cytokeratin antibody (BioGenex Laboratories). Lung
blood vessels were visualized by FITC-lectin (green).
Figure 5. Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RTPCR) to detect the presence of tumor cells in the lung.
Semiquantitative RT–PCR was used to detect the presence of
prostate-specific antigen (PSA)-expressing human cancer cells.
The animals in the left and right panel received 3.6×107 and
7.2×107 infectious units of AdPSE-BC-FL, respectively. At 21 days
after viral injection, the animal in the left and right panel displayed
positive and negative lung signals, respectively, after organ
isolation. Thirty-five cycles of PCR amplifications performed on
the lung extract revealed a low-intensity positive band detected by
PSA-specific primers (the animal in the left panel). No PSA
transcripts were detected in the lung of the optically silent animal
(right panel). Androgen receptor RNA was detected in the lung of
non-tumor bearing (naïve) animals (negative control). Tumor
tissue
extract
served
as
positive
control.
Figure 6. Dynamic imaging of androgen receptor (AR)
function in tumors. LAPC-9 tumors grafted in SCID mice
were injected with 107 infectious units of AdTSTA-FL.
Optical signals were monitored by charged coupled device
imaging repetitively at the specified days following
injection. Animals castrated at 5 days following viral
administration displayed a more rapid decay of intratumoral
signal, compared with the non-castration animal. AR
immunohistochemical staining of the respective tumors
showed that depletion of testicular androgen correlated
with the diffusion of AR into cytoplasm, compared with a
predominant nuclear localization in the intact animals.
Heterogeneity in AR staining was observed in tumors, both
in
intact
or
castrated
animals.
Cationic polymers most frequently used for nucleic acid delivery.
Example of a polyplex modification with triggered intracellular
DNA release. RPC, reductively cleavable linear polycations