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UNIVERSIDADE COMUNITÁRIA DA REGIÃO DE CHAPECÓ - UNOCHAPECÓ
Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais
Riciéri Naue Mocelin
EFEITOS DA N-ACETILCISTEÍNA SOBRE PARÂMETROS
COMPORTAMENTAIS EM PEIXES-ZEBRA
Chapecó – SC, 2015
2 UNIVERSIDADE COMUNITÁRIA DA REGIÃO DE CHAPECÓ
Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais
EFEITOS DA N-ACETILCISTEÍNA SOBRE PARÂMETROS
COMPORTAMENTAIS EM PEIXES-ZEBRA
Riciéri Naue Mocelin
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação
da
Universidade
Comunitária da região de Chapecó,
como parte dos pré-requisitos para a
obtenção do título de Mestre em
Ciências Ambientais.
Orientadores: Prof. Dr. Angelo Piato
Prof. Dra. Leila Zanatta
Chapecó – SC, 2015
3 RESUMO
MOCELIN, Ricieri Naue. Efeitos da N-acetilcisteína sobre parâmetros comportamentais
em peixes-zebra. Dissertação (Mestrado). Universidade Comunitária da Região de
Chapecó, 2014, 44p.
Os transtornos de ansiedade apresentam elevada prevalência e podem causar impactos
importantes na qualidade de vida dos indivíduos. Para o tratamento desses transtornos
são utilizados ansiolíticos, fármacos com eficácia limitada e com relevante incidência de
efeitos adversos. Dessa forma, é fundamental a busca por novos compostos mais
eficazes e com menos efeitos adversos. Nesse contexto, considerando o papel da Nacetilcisteína (NAC) como modulador de importantes sistemas de neurotransmissão
relacionados a psicopatologias, o objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos da
exposição à NAC sobre parâmetros comportamentais em peixes-zebra. Peixes-zebra de
ambos os sexos foram expostos à NAC (0,1, 1,0 e 10,0 mg/L), fluoxetina (10,0 mg/L)
ou bromazepam (1,5 mg/L) por 10 minutos. Posteriormente, os animais foram
individualmente submetidos aos testes comportamentais. Os protocolos experimentais
foram aprovados pela CEUA-Unochapecó (nº 019/13). Os resultados foram analisados
por ANOVA de uma ou duas vias seguida do post-hoc de Tukey (n=12-15).
Inicialmente, avaliou-se o efeito da NAC e fluoxetina no teste de tanque novo por 6
min. NAC não alterou nenhum parâmetro comportamental, enquanto que animais
expostos à fluoxetina apresentaram significativamente aumento no tempo de
permanência na porção superior do aquário (p<0,01 x controle). No segundo protocolo,
avaliou-se o efeito da NAC em um modelo de estresse agudo por perseguição. Após os
tratamentos, animais foram perseguição com uma rede por 2 minutos e submetidos ao
teste de tanque novo. NAC preveniu as alterações comportamentais induzidas pelo
estresse agudo por perseguição. No terceiro protocolo, peixes-zebra foram expostos aos
tratamentos anteriores e submetidos ao teste de claro-escuro. Animais expostos à NAC
aumentaram significativamente o tempo de permanência no lado claro do aparato em
relação ao controle (p<0,05). Esse efeito foi comparável ao ansiolítico bromazepam. Os
resultados do presente estudo demonstram pela primeira vez que a NAC possui
propriedades anti-estresse e tipo-ansiolítica em peixes-zebra, com o potencial de
prevenir desordens psiquiátricas induzidas pelo estresse, tais como ansiedade e
depressão. Mais estudos são necessários para justificar o uso da NAC em transtornos
psiquiátricos.
Palavras-chave: N-acetilcisteína; Ansiedade; Estresse; Peixe-zebra.
4 ABSTRACT
MOCELIN, Ricieri Naue. Effects of N-acetylcysteine on behavioral parameters in
zebrafish. Dissertation (Master). Universidade Comunitária da Região de Chapecó,
2014, 44p.
Anxiety disorders have high prevalence and may cause significant impacts on the life
quality of the individuals. For the treatment of these disorders are used anxiolytics,
drugs with limited effectiveness and significant incidence of adverse effects. Thus, it is
essential to search for new compounds, more effective and with fewer side effects.
Considering the role of N-acetylcysteine (NAC) as a modulator of important
neurotransmission systems related to psychopathology, the aim of this study was to
evaluate the effects of exposure to NAC on behavioral parameters in zebrafish.
Zebrafish of both sexes were exposed to NAC (0.1, 1.0 and 10.0 mg/L), fluoxetine (10.0
mg/L) or bromazepam (1.5 mg/L) for 10 minutes. After, the animals were individually
subjected to behavioral testing. The experimental protocols were approved by CEUAUnochapecó (No. 019/13). Results were analyzed by one or two ways ANOVA
followed by Tukey post-hoc (n= 12-15). Initially we evaluated the effect of NAC and
fluoxetine in the novel tank test for 6 min. NAC did not change any behavioral
parameters evaluated, while animals exposed to fluoxetine showed significantly
increased time in the upper portion of the tank (p<0.01 x control). In the second
protocol, we evaluated the effect of NAC in an acute stress model for persecution. After
the treatments, animals were chased with a net for 2 minutes and submitted to the novel
tank test. NAC prevented the behavioral changes induced by acute stress. In the third
protocol, zebrafish were exposed to previous treatments and subjected to the light-dark
test. Animals exposed to NAC significantly increased the time spent in the light side of
the apparatus compared to control (p<0.05). This effect was comparable to
bromazepam. The results of this study demonstrated for the first time that NAC has
anti-stress properties and anxiolytic-like effects in zebrafish, to potentially prevent the
stress-induced psychiatric disorders such as anxiety and depression. More studies are
needed to justify the use of NAC in psychiatric disorders.
Keywords: N-acetylcysteine; anxiety; stress; Zebrafish.
5 LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Schematic representation of the experimental protocol................................. 33
Figura 2 - Effects of NAC (0.1, 1.0 and 10.0 mg/L) and FLU (10.0 mg/L) on total
distance traveled (A), number of crossings (B), maximum speed (C), time in the bottom
(D), time in the middle (E), and time in the upper zone of the tank (F) in the novel tank
test in zebrafish............................................................................................................... 34
Figura 3 - Effects of NAC (0.1, 1.0 and 10.0 mg/L) and FLU (10.0 mg/L) on total
distance traveled (A), number of crossings (B), maximum speed (C), time in the bottom
(D), time in the middle (E), and time in the upper zone of the tank (F) in the acute stress
test in zebrafish............................................................................................................... 35
Figura 4 - Effects of NAC (0.1, 1.0 and 10.0 mg/L) and BMZ (1.5 mg/L) on time in the
lit side of the tank (A), latency to first crossing (B) and number of crossings (C) in the
light/dark test.................................................................................................................. 36
6 LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Principais ansiolíticos utilizados na clínica................................................... 11
7 LISTA DE ABREVITAURAS
5-HT
Serotonina
AMPA
α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol propiônico
BZP
Benzodiazepínicos
DSM-V
Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais 5ª (V) edição
EROs
Espécies Reativas de Oxigênio
GABA
Ácido Gama-aminobutírico
GSH
Glutationa
ISRS
Inibidor Seletivo da Recaptação de Serotonina
mGluR
Receptor Glutamatérgico do tipo Metabotrópico
NAC
N-acetílcisteína
NMDA
N-metil-D-aspartato
NOR
Noradrenalina
SNC
Sistema Nervoso Central
TST
Tail Suspension Test (Teste de Suspensão pela Cauda)
8 SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 09
2 OBJETIVOS ............................................................................................................. 17
2.1 Objetivo geral .......................................................................................................... 17
2.2 Objetivos específicos .............................................................................................. 17
3 ARTIGO CIENTÍFICO ......................................................................................... 18
3.1 Introduction ............................................................................................................. 21
3.2 Materials and Methods ............................................................................................ 22
3.3 Results ..................................................................................................................... 24
3.4 Discussion ............................................................................................................... 25
Referênces ..................................................................................................................... 28
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................. 37
REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 39
9 1
INTRODUÇÃO
As psicopatologias causam impactos importantes na vida das pessoas e na
sociedade. Uma meta-análise realizada por Walker e colaboradores (2015) mostrou que
a mortalidade é maior entre os pacientes com algum tipo de transtorno mental em
comparação à população geral. Alterações no estado mental são responsáveis por cinco
a cada dez das principais causas da incapacidade e morte prematura (Insel et al., 2013).
O custo global para o tratamento de distúrbios de saúde mental em 2010 foi de 2,5
trilhões de dólares e deverá aumentar para 6,5 trilhões até 2030 (Bloom et al., 2011).
Além disso, é estimado que aproximadamente 14% das mortes em todo mundo seja
atribuída a algum transtorno mental (Walker et al., 2015). Esse panorama é agravado
pelo fato de que indústrias farmacêuticas estão investindo cada vez menos em pesquisa
e desenvolvimento de novos psicofármacos e retirando ou redirecionando seus esforços
para outras áreas (Insel and Sahakian, 2012). Um dos motivos para essa perda de
interesse é que os psicofármacos atualmente disponíveis no mercado apresentam
eficácia limitada e alta incidência de efeitos adversos. Além disso, apesar do grande
número de novos compostos satisfatoriamente avaliados em estudos pré-clínicos, a
maior parte desses candidatos falha nos estudos clínicos (Insel, 2012). Sabe-se que
aproximadamente 80% de indiferentes compostos já testados falharam na Fase II dos
ensaios clínicos e 70% dos resultados pré-clínicos não são replicáveis (Kola and Landis,
2004).
A ansiedade é um transtorno psiquiátrico crônico e frequentemente
incapacitante, representando um alto custo para os indivíduos, para as famílias e para a
sociedade (Kessler et al., 2007). Esse transtorno induz importante morbidade
neuropsicológica, sendo a forma mais comum de transtorno psiquiátrico, afetando cerca
de 25 a 30% da população e ocorrendo em pelo menos um episódio durante a vida
(Kessler et al., 2005). De acordo com o Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos
Mentais (DSM-V, 2014), os transtornos de ansiedade são classificados em: transtorno
de ansiedade de separação, transtorno de pânico, agorafobia, transtorno de ansiedade
social (fobia social), transtorno de ansiedade generalizada, transtorno de ansiedade
10 induzida por substância, transtorno de ansiedade associado a outra condição médica e
transtorno de ansiedade sem outras especificações.
O tratamento dessa psicopatologia é realizado através de assistência psicológica
e farmacoterapia; no entanto, se estima que cerca de 40-50% dos pacientes são
refratários (Wu et al., 2012). Os fármacos de primeira escolha para o tratamento são os
ansiolíticos (benzodiazepínicos e não-benzodiazepínicos), os antidepressivos (inibidores
seletivos da recaptação de serotonina (5-HT) (ISRS) e os inibidores da recaptação de 5HT e noradrenalina (NOR)). No entanto, esses fármacos causam diversos efeitos
colaterais, incluindo sonolência, sedação e diminuição da coordenação motora (no caso
dos benzodiazepínicos (BZP)), disfunções sexuais, gastrointestinais e de sono (no caso
dos antidepressivos) (Wu et al., 2012), O uso crônico dos BZP pode provocar tolerância
e/ou dependência, além de síndrome de abstinência e altas doses podem ser fatais,
principalmente se utilizadas com outros depressores do SNC (Goodman and Gilman,
2012). Além disso, os ISRS funcionam adequadamente em apenas 30-40% dos
pacientes (Stein and Andrews, 2015). Tanto o uso de BZD como o de ISRS está
associado ao aumento na taxa de suicídio, sendo esse aumento de 31% e 45% para
antidepressivos e BZD, respectivamente (Tiihonen et al., 2015).
Os principais ansiolíticos (e nomes comerciais), o mecanismo de ação e os
principais efeitos adversos estão descritos na tabela 1 abaixo.
Tabela 1: Principais ansiolíticos utilizados na clínica.
(BZP)
Benzodiazepínicos
Princípio Ativo
Nome Comercial
Diazepam
Valium®
Clonazepam
Rivotril®
Oxazepam
Serax®
Bromazepam
Somalium®
Lorazepam
Lorax®
Alprazolam
Frontal®
Mecanismo de Ação
Efeitos Adversos
Modula os efeitos póssinápticos da transmissão
de GABAA, resultando
num aumento da inibição
pré-sináptica.
Sedação, leve perda de
memória, diminuição do
estado de alerta, tempo
reação retardado, déficit
visuais-espaciais,
reações
amnésicas, irritabilidade
11 ISRS
IRSN
Antidepressivos
Antidepressivos
Agonista 5-HT1A
Buspirona
Buspar®
Gabapentina
Neurotin®
Fluoxetina
Prozac®
Sertralina
Zoloft®
Paroxetina
Paxil®
Citalopram
Celexa®
Escitalopram
Lexapro®
Venlafaxina
Efexor XR®
Duloxetina
Cymbalta®
Agonista parcial seletivo
nos receptores 5-HT1A e
5-HT2 de 5-HT. Possui
moderada afinidade por
receptores
D2
de
dopamina. Sem qualquer
efeito sob GABA.
Análogo
de
GABA,
modula a ação da enzima
ácido
glutâmico
descarboxilase
e
da
enzima
glutamato
sintetase.
Medeia a recaptação de 5HT no terminal présinaptico; bloqueia a
recaptação resultando em
neurotransmissão
serotoninérgica
aumentada e prolongada,
provocando estimulação
de autorreceptores 5-HT.
Inibem tanto a recaptação
de
5-HT
quanto
noradrenalina. Provocam
aumento
da
neurotransmissão
serotoninérgica
e/ou
noradrenérgica, induzindo
a
ativação
de
autorreceptores 5-HT.
Tontura, sonolência, náusea,
dor de cabeça, visão turva,
confusão, diarreia, insônia,
tremor.
Depressão do SNC, tontura,
sonolência, ataxia, edema
periférico, fadiga.
Cefaléia, náusea e outros
efeitos
Gastrointestinais,
tremor, insônica, disfunção
sexual.
Náusea, tontura, boca seca,
cefaleia, elevação da pressão
arterial.
Náusea, tontura, insônia,
cefaleia, constipação.
Fontes: As Bases Farmacológicas da Terapêutica (Goodman & Gilman, 12ª, 2012); Farmacologia Básica e Clínica (Katzung, 12ª,
2014); Guia de Farmacoterapia (Martin & Talbert, 1ª, 2015); MEDSCAPE, disponível em: www.medscape.com, acesso em: 20 de
Junho de 2015.
As bases neurobiológicas dos transtornos de ansiedade não são completamente
conhecidas. Diversos sistemas de neurotransmissores estão envolvidos aos transtornos
de ansiedade, como por exemplo, gabaérgico, serotonérgico, glutamatérgico, além de
outros neurotransmissores, neuromoduladores e peptídeos (Freitas-Ferrari et al., 2010).
Estima-se que 20-30% dos neurônios do SNC são gabaérgicos, sendo o principal
neurotransmissor inibitório (Olsen and Sieghart, 2009; Ulrich and Bettler, 2007). Os
receptores GABAA são os alvos moleculares dos BZP que atuam sobre receptores
ionotrópicos e metabotrópicos. Os receptores ionotrópicos mediam a transmissão
inibitória rápida do SNC, potencializando a afinidade do GABA pelo receptor. Logo,
ocorre abertura de canais de cloreto e hiperpolarização do neurônio pós-sináptico
provocando inibição de processos intracelulares (Rudolph and Knoflach, 2011). São
divididos em dois tipos principais: A e B. O receptor GABAA contém duas subunidades
12 α, duas subunidades β e uma subunidade γ com dois sítios de ligação formados por
subunidades α e β. Já o receptor GABAB ou metabotrópico funcionam como
autorreceptores pois inibem a liberação de GABA e são divididos em GABABR1 e
GABABR2 (Rudolph and Knoflach, 2011).
O sítio de ligação dos BZP é formado por uma das subunidades α (α1, α2, α3 ou
α5) e uma subunidade γ (possivelmente γ2 por estar presente em 90% dos receptores
GABAA) (Goodman and Gilman, 2012). A identificação das funções fisiológicas e
farmacológicas dos diferentes subtipos de receptores GABAA (Low et al., 2000;
Crestani et al., 2001; Crestani et al., 2002) é essencial para a busca e desenvolvimento
de fármacos com menores efeitos colaterais que os BZP (ex.: ansiolíticos não-sedativos)
ou compostos com indicações distintas dos BZP (ex.: fármacos de melhora cognitiva e
analgésicos) através de uma maior afinidade apenas ao subtipo do receptor desejado, a
exemplo do valor terapêutico para danos cognitivos da esquizofrenia de agonistas
seletivos de receptores GABAA de subunidade α1 e α2 (Rudolph and Knoflach, 2011).
Constituído por receptores acoplados à proteína G (5-HT1, 5-HT2, 5-HT4-7) e
receptor de canal iônico (5-HT3), os receptores de serotonina são classificados em 14
subtipos (5-HT1A,
1B, 1D, 1E, 1F, 2A, 2B, 2C, 3, 4, 5A, 5B, 6 e 7
) (Goodman and Gilman, 2012). A
serotonina e seus receptores desempenham papéis críticos na regulação da cognição,
comportamento alimentar e sexual e humor (Lambe et al., 2011). Os receptores são
expressos no córtex pré-frontal humano e desenvolvem excitabilidade desta região do
SNC, agindo como um neuromodulador para regulação emocional e resiliência (Bland
et al., 2003; Holmes, 2008; Krystal and Neumeinster, 2009).
Desequilíbrios no sistema serotonérgico estão relacionados à etiologia de
diversos transtornos psiquiátricos (Hetrick et al., 2007; Olivier et al., 2010). Receptores
de serotonina do tipo 5-HT1A e 5-HT2A parecem ter efeitos opostos sobre a ansiedade;
por exemplo, a inibição de receptores 5-HT1A (Lanzenberger et al., 2007) e ativação de
receptores 5-HT2A (Weisstaub et al., 2006) podem estar relacionados à atividade tipoansiolítica em ratos. A inibição do receptor 5-HT5A pode influenciar nas condições
ansiolíticas sob estresse (Lambe et al., 2011). A buspirona, prescrito para transtornos de
ansiedade, é um agonista parcial dos receptores 5HT1A e classificado como um nãoBZP. Atua sobre os receptores serotonérgicos 5HT1A pré-sinápticos acarretando na
13 diminuição da frequência de liberação de serotonina e noradrenalina (Goodman and
Gilman, 2012). O efeito terapêutico não é observado com o uso agudo do fármaco,
necessitando de vários dias de tratamento para que a resposta farmacológica se torne
evidente.
Anormalidades no sistema glutamatérgico têm sido observadas em várias
doenças psiquiátricas, como esquizofrenia e transtorno obsessivo compulsivo
(Deepmala et al., 2015). O glutamato extracelular é regulado principalmente pelo
trocador cistina-glutamato localizado nas células gliais (Bauzo et al., 2012). Esse
sistema troca cistina extracelular por glutamato intracelular (Kupchik et al., 2012),
também possui importante papel na produção de glutationa (GSH), sintetizada por Lcistina, desempenhando a regulação do estresse oxidativo (Wang and Cynader, 2000).
Os
receptores
glutamatérgicos
são
classificados
em
ionotrópicos
e
metabotrópicos. Os ionotrópicos são divididos em α-amino-3-hidroxi-5-metil-4isoxazol
propiônico
(AMPA),
N-metil-D-aspartato
(NMDA)
e
Cainato.
Os
metabotrópicos são subdivididos em grupo 1, 2 e 3 (mGluR) (Goodman & Gilman,
2012). O sistema glutamatérgico tem se mostrado importante na fisiopatologia e
terapêutica de doenças psiquiátricas, em transtornos de humor, o sistema foi proposto
com base em dados pré-clínicos de antagonistas NMDA (Zarate et al., 2006).
Um excesso de glutamato pode levar a ativação NDMA que por sua vez provoca
danos e degeneração neuronal devido a um possível e significativo influxo de Ca2+ nos
neurônios (Barger and Basile, 2001; Piani and Fontana, 1994; Sattler and Tymianski,
2001). A ativação de receptores metabotrópicos tipo 1 (mGlu1) pode ser neurotóxico
por inibir a neuroproteção contra espécies reativas de oxigênio (EROs) e uma
significativa perda de GSH intracelular (Deng et at., 2004).
A partir da década de 80, o sistema glutamatérgico passou a ser alvo de estudos
e vem ganhando grande interesse na pesquisa relacionada a distúrbios psiquiátricos e
comportamentais. Evidência dessa ação é marcadamente destacada pela rápida ação
antidepressiva do antagonista de receptores NMDA cetamina quando administrada em
diferentes doses (Murrough et al., 2013; Sos et al., 2013; Zarate et al., 2012; Zarate et
al., 2006), o que pode sugerir um novo alvo de resposta clínica antidepressiva de
maneira eficaz com ação em 3 horas (Diazgranados et al., 2010). Sendo o glutamato
14 uma molécula presente em todo o sistema nervoso central, cuja transmissão está sujeita
a uma fina regulação e que ao mesmo tempo em que é modulado também modula vários
outros sistemas de neurotransmissores, se tornando um alvo farmacológico importante
na área de psiquiatria (Hashimoto, 2011).
A alta incidência de transtornos psiquiátricos na população, especialmente os
transtornos de ansiedade, associada à falta de eficácia clínica dos ansiolíticos e a alta
incidência de efeitos adversos, funciona como um motivador na busca de compostos
com melhor eficácia clínica e menor incidência de efeitos adversos.
A N-acetilcisteína (NAC) é um antioxidante, mucolítico e também utilizado no
tratamento de intoxicação por paracetamol (Dean et al., 2011a). Esse fármaco apresenta
boa tolerabilidade e baixa incidência de efeitos adversos (Whyte et al., 2007), apesar de
não existir estudos a longo prazo. Alguns efeitos adversos com altas doses foram
pontualmente relatados, como hipertensão arterial em ratos (Palmer et al., 2007) e
estado epilético com hipertensão intracraniana e posterior morte do paciente (Bailey et
al., 2004). Apesar disso, baixas doses a NAC podem ser utilizadas como adjuvante para
o tratamento de epilepsia (Devi et al., 2006).
Estruturalmente, a NAC é derivada de N-acetil do aminoácido L-cisteína.
Precursora de cisteína, a NAC age no trocador cistina-glutamato presente em astrócitos,
aumentando a quantidade de glutamato extrassináptico (Baker et al., 2008). Essa
elevação promove uma maior ativação de receptores metabotrópicos de glutamato
(mGlu2/3) localizados no espaço extra sináptico, resultando em diminuição da liberação
sináptica de glutamato e consequente redução na ativação de receptores glutamatérgicos
pós-sinápticos, especialmente do tipo NMDA (Dean et al., 2011b).
O efeito da NAC em modelos pré-clínicos (Herrmann et al., 2014; Lee et al.,
2014; Costa-Campos et al., 2013; Linck et al., 2012; Bauzo et al., 2012) e clínicos
(Dean et al., 2015; Oliver et al., 2015; Prado et al., 2015; Nikoo et al., 2015; Liu et al.,
2014; Grant et al., 2014; Berk et al., 2013; Berk et al., 2008) têm sido recentemente
avaliados. Herrmann e colaboradores (2014) demonstraram a capacidade da NAC em
prevenir a hipersensibilidade induzida por anfetamina no modelo de isolamento social
em camundongos, sugerindo assim que o composto pode ser útil na intervenção de
pacientes com riscos de desenvolver psicoses. O uso da NAC também já foi
15 preliminarmente documentado em transtornos de ansiedade, como por exemplo, na
tricotilomania (Grant et al., 2009), mas seu efeito ansiolítico não foi caracterizado em
modelos animais, que podem identificar usos específicos bem como potenciais efeitos
adversos. Outra particularidade da NAC está na sua capacidade de reduzir as citocinas
pró-inflamatórias (IL-1β e TNF-α) conferindo assim uma atividade anti-inflamatória
(Chen et al., 2008; Khan et al, 2004; Malhi and Berk, 2007; Oja et al., 2000).
A ansiedade pode causar estresse oxidativo, o qual pode ser definido como o
desequilíbrio entre a formação e remoção de agentes oxidantes no organismo,
decorrente da geração excessiva de EROs incluindo radicais livres, e/ou diminuição de
antioxidantes endógenos (Ng, et al., 2008). A GSH é um antioxidante endógeno e a
NAC induz a reposição de GSH no SNC, podendo trazer resultados positivos
relacionados a doenças psiquiátricas, como a ansiedade (Fries and Kapczinski, 2011).
Estudos apontam ainda que a introdução de modeladores de glutamato como a NAC,
pode ser uma possibilidade promissora para o tratamento de distúrbios de humor, uma
vez que o glutamato é considerado como o caminho final comum de tratamento
terapêutico para a depressão e outros distúrbios de humor como a ansiedade (CostaCampos, et al., 2013).
Os fármacos atualmente disponíveis para o tratamento da ansiedade apresentam
limitações como síndrome de abstinência, tolerância, dependência, além de alguns
apresentarem baixa eficácia e outros ainda necessitarem de mais estudos para
elucidação de seu mecanismo de ação. Com isso, torna-se necessária a busca de novos
compostos ou então propor um novo uso a um conhecido fármaco já disponível na
clínica, com menores efeitos adversos e melhor eficácia clínica em transtornos
psiquiátricos além do mecanismo de ação inovador. Com isso, existe uma oportunidade
de os cientistas praticarem o que chamam de “Repurposing” de compostos que já
superaram e passaram pelos obstáculos de desenvolvimento, verificando assim possíveis
relações com a psiquiatria (Insel et al., 2013).
Nesse contexto, considerando o papel da NAC como agente modulador em
diversas vias relevantes aos transtornos psiquiátricos, o objetivo desse trabalho foi
avaliar os efeitos comportamentais da NAC em peixes-zebra.
16 2
OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar os efeitos comportamentais da N-acetilcisteína (NAC) em peixes-zebras.
2.2 Objetivos Específicos
2.2.1
Avaliar os efeitos comportamentais da exposição à NAC (0,1, 1,0 e 10
mg/L) e fluoxetina (10,0 mg/L) no teste de tanque novo em peixes-zebra.
2.2.2
Avaliar os efeitos comportamentais da exposição à NAC (0,1, 1,0 e 10
mg/L) em peixes-zebra submetidos a um protocolo de estresse agudo;
2.2.3
Avaliar os efeitos comportamentais da exposição à NAC (0,1, 1,0 e 10
mg/L) e bromazepam (1,5 mg/L) no teste de claro/escuro em peixes-zebra.
17 3
MATERIAIS E MÉTODOS, RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os tópicos descritos acima fazem parte de um artigo submetido à Revista
Pharmacology, Biochemistry and Behavior (carta de submissão a seguir).
18 N-acetylcysteine prevents stress-induced anxiety behavior in zebrafish
Ricieri Mocelina,1, Ana P. Herrmannb,1, Matheus Marcona, Cassiano L. Ramboc, Aline
Rohdena, Fernanda Bevilaquaa, Murilo Sander de Abreud, Leila Zanattaa, Elaine
Elisabetskyb, Leonardo J.G. Barcellosd,e, Diogo R. Larac,g, Angelo L. Piatof,g(*)
a
Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais, Universidade Comunitária da Região de Chapecó.
Av. Senador Attílio Fontana, 591E, 89809-000, Chapecó, SC, Brazil.
b
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande
do Sul. Rua Ramiro Barcelos, 2600, 90035-000, Porto Alegre, RS, Brazil.
c
Laboratório de Neuroquímica e Psicofarmacologia, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e
Molecular, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul. Av. Ipiranga, 6681, 90619-900, Porto
Alegre, RS, Brazil.
d
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Universidade Federal de Santa Maria. Campus
Universitário, Camobi, 97105-900, Santa Maria, RS, Brazil.
e
Programa de Pós-Graduação em Bioexperimentação, Universidade de Passo Fundo.
BR 285, 99052-900, Passo Fundo, RS, Brazil.
f
Laboratório de Psicofarmacologia e Comportamento, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia e
Terapêutica, Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Av. Sarmento Leite 500/202, 90050-170, Porto
Alegre, RS, Brazil.
g
Zebrafish Neuroscience Research Consortium (ZNRC).
1
These authors contributed equally for this article.
(* )
Correspondence to:
Angelo L Piato, Ph.D.
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia e Terapêutica, ICBS, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Av. Sarmento Leite 500/305, Porto Alegre, RS, Brazil
90050-170
Phone/Fax: +55 51 33083121
E-mail address: [email protected]
19 Abstract
Despite the recent advances in understanding the pathophysiology of anxiety
disorders, the pharmacological treatments currently available are limited in efficacy and
induce serious side effects. A possible strategy to achieve clinical benefits is drug
repurposing, i.e., discovery of novel applications for old drugs, bringing new treatment
options to the market and to the patients who need them. N-acetylcysteine (NAC), a
commonly used mucolytic and paracetamol antidote, has emerged as a promising
molecule for the treatment of several neuropsychiatric disorders. The mechanism of
action of this drug is complex, and involves modulation of antioxidant, inflammatory,
neurotrophic and glutamate pathways. Here we evaluated the effects of NAC on
behavioral parameters relevant to anxiety in zebrafish. NAC did not alter behavioral
parameters in the novel tank test, prevented the anxiety-like behaviors induced by an
acute stressor (net chasing), and increased the time zebrafish spent in the lit side in the
light/dark test. These data may indicate that NAC presents an anti-stress effect, with the
potential to prevent stress-induced psychiatric disorders such as anxiety and depression.
The considerable homology between mammalian and zebrafish genomes invests the
current data with translational validity for the further clinical trials needed to
substantiate the use of NAC in anxiety disorders.
Key words: N-acetylcysteine; Anxiety; Stress; Zebrafish.
20 1. Introduction
Despite the recent advances in understanding the pathophysiology of psychiatric
disorders, pharmaceutical industries are increasingly abandoning drug development
programs in this field. Exorbitant financial losses consequent to high failure rates in
early stage clinical trials are the most likely explanation for this current situation, which
includes arrested development of agents once considered as promising novel treatments
(Insel 2012). A possible strategy to bypass this drug pipeline drain is the repurposing of
available drugs, which reduces uncertainty regarding safety and pharmacokinetic issues
and allows a faster track to achieve clinical benefits (Ashburn and Thor 2004; Insel et
al. 2013).
N-acetylcysteine (NAC) – a commonly used mucolytic and paracetamol antidote
– has emerged as a promising molecule for the treatment of several neuropsychiatric
disorders, such as bipolar disorder, schizophrenia and drug addiction (Dean et al. 2011a;
Berk et al. 2013). The myriad of positive clinical data is related to the multi-target
profile of NAC, which modulates antioxidant, inflammatory, neurotrophic and
glutamate pathways (Dean et al. 2011b). Specifically for glutamate, NAC activates the
astrocytic cystine-glutamate antiporters, leading to glutamate release, stimulation of
extra-synaptic
metabotropic
glutamate
receptors
(mGluRs)
and
decreased
neurotransmitter synaptic release (Baker et al. 2002; Moran et al. 2005).
When an organism is subjected to stressful situations, the innate stress response
activates several biologic systems in order to elicit coping strategies and restore
homeostasis (Chrousos and Gold 1992; McEwen 2007; Gold 2015).
There are,
however, maladaptive responses to stressors, which are closely linked to the
development of anxiety disorders and depression (Sapolsky et al., 2000). Although no
approved treatment for stress and anxiety targets the glutamatergic system, there is
consistent experimental evidence implicating glutamate in the pathophysiology of
anxiety disorders (Cortese and Phan 2005; Riaza Bermudo-Soriano et al. 2012; Griebel
and Holmes 2013; Pitsikas 2014).
Anxiety is the most prevalent psychiatric disorder (Kessler et al. 2005), affecting
millions of people globally. NAC has already been proposed as a potential drug for the
management of anxiety, but clinical and pre-clinical data are limited (Lafleur et al.
21 2006; Berk et al. 2009, 2009, 2014; Egashira et al. 2012; Bloch et al. 2013). Our aim is
to add experimental evidence to the body of knowledge on this field, and thus subsidize
the required future clinical trials. Here we evaluated the effects of NAC on behavioral
parameters relevant to anxiety in zebrafish.
2. Materials and Methods
2.1 Animals
A total of 234 wild-type short-fin strain adult zebrafish (Danio rerio, 4-6 months
old, 50:50 male:female ratio) were obtained from the heterogeneous breeding stock of
Universidade de Passo Fundo. The fish were kept in 40-L aquariums (80-100 fish per
tank), filled with non-chlorinated filtered water, with a light/dark cycle of 14/10 hours
(lights on at 7:00 AM), for at least 2 weeks before experiments. Tank water was
partially changed every 7 days and maintained under appropriate conditions for this
species: 26 ± 1 °C; pH 7.0 ± 0.20; dissolved oxygen at 7.0 ± 0.5 mg/L; total ammonia at
< 0.01 mg/L; total hardness at 5.8 mg/L and alkalinity at 22 mg/L CaCO3. Water was
not changed for at least 1 day before experiments. The fish were fed twice a day with a
commercial flake fish food (Alcon BASIC®, Alcon, Brazil). All protocols were
approved by the Ethics Committee of Unochapecó (#019/2013).
2.2 Chemicals
N-acetylcysteine (NAC) was acquired from Sigma-Aldrich (St Louis, Missouri,
USA). Bromazepam (BMZ, Lexotan®) was acquired from Roche (Rio de Janeiro,
Brazil) and fluoxetine (FLU, Daforin®) from Sigma Pharma (São Paulo, Brazil).
2.3 Experimental design
The experimental design is shown in Figure 1. Four fish at the time were placed
(10 min) into a beaker filled with 400 mL of each of the following solutions (treatment
groups): control (water), fluoxetine (FLU, 10.0 mg/L), bromazepam (BMZ,1.5 mg/L) or
NAC (0.1, 1.0 and 10.0 mg/L). Fluoxetine and bromazepam were used as positive
controls since they are widely prescribed for anxiety disorders. Fresh solutions were
22 prepared for every group of four fish. Immediately after treatment, animals were
individually transferred to the unfamiliar behavioral apparatus, video recorded and latter
analyzed by the ANY-Maze software (Stoelting Co., USA). Tests were performed
between 08:00 and 11:00 AM. Separate groups of fish received each drug and
completed each assay.
2.4 Behavioral tests
2.4.1 Novel tank
The novel tank test consists of a 2.7-L tank (24 x 8 x 20 cm) filled with water up
to 15 cm (Gebauer et al. 2011; Piato et al. 2011). The apparatus was virtually divided
into three equal horizontal zones (bottom, middle and upper). The following parameters
were evaluated for 6 minutes: total distance traveled, number of crossings among
different zones, maximum swimming speed, time in the bottom, middle and upper zones
of the tank. Vertical location in a novel environment is considered a parameter of
anxiety in zebrafish analogous to the thigmotaxic behavior that rodents display in an
open field (Levin et al., 2007).
2.4.2 Acute stress
The acute stress protocol was performed according to (Abreu et al. 2014). After
the 10-min treatment, fish were chased for two minutes with a net before transferred to
the novel tank test for 6 minutes; the same parameters described above were noted. The
same trained experimenter executed the net chasing stress in all tests (circular clockwise movements with the net in the beaker, at a regular speed of approximately 40 turns
per minute).
2.4.3 Light/dark
The light/dark test was performed according to Gebauer et al. (2011). The
apparatus consists of a glass tank (18 x 9 x 7 cm) divided by a sliding guillotine-type
partition (9 x 7 cm) in two equally sized dark and white compartments. The water level
was 3 cm and the partition was raised 1 cm above the tank floor to allow zebrafish to
23 swim freely between the two sides of the tank. Fish were individually placed in the light
zone of the apparatus immediately after treatment and the time spent in the light
compartment, the latency to enter the dark compartment, and the number of crossings
between compartments were recorded for 5 min.
2.5 Statistics
The data is expressed as mean ± standard error of mean (S.E.M). The normal
distribution of the data was confirmed by Kolmogorov-Smirnov and Levene tests, and
results analyzed by one- or two-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test. Twoway ANOVA was used to identify the main effects of stress and treatment, as well as
their interactions. Differences were considered significant at p<0.05.
3. Results
Figure 2 shows the effects of FLU (10.0 mg/L) and NAC (0.1, 1.0 and 10.0
mg/L) in the novel tank test. As expected, FLU significantly decreased the time spent in
the bottom (Fig. 2D) and increased the time spent the upper (Fig. 2F) part of the tank
(F4,66 = 3.4, p<0.01 and F4,66 = 2.8, p<0.01, respectively), whereas NAC was devoid of
effects. Neither FLU nor NAC altered any of the other novel tank parameters.
Figure 3 shows the effects of NAC in the acute stress test in zebrafish, and table
1 summarizes the two-way ANOVA analysis. Treatment with NAC prevented the
effects of stress on total distance traveled (Fig. 3A), and attenuated the stress-induced
decrease on number of crossings among the horizontal zones of the tank (Fig. 3B). For
maximum speed (Fig. 3C), post hoc analyses did not indicate significant differences
among the groups. Zebrafish submitted to acute stress test significantly spent more time
in the bottom (Fig. 3D) and less time in the middle and upper zones of the tank (Fig. 3E
and 3F), and NAC prevented these effects.
Figure 4 shows the effects of BMZ (10.0 mg/L) and NAC (0.1, 1.0 and 10.0
mg/L) in the light/dark test. Both BMZ and NAC significantly increased the time spent
in the lit side of the tank when compared to control (F4,62 = 6.4, p<0.001, Fig. 4A). NAC
significantly decreased the latency to first crossing (F4,62 = 5.3, p<0.001, Fig. 4B). The
24 number of crossings between the light and dark compartments was not altered by any of
the treatments (F4,62 = 1.5, p>0.05, Fig. 4C).
4. Discussion
Here we demonstrate for the first time that NAC has anti-stress and anxiolytic
properties in zebrafish, adding to a cross-species body of evidence for NAC anxiolytic
effects. NAC increased the time zebrafish spent in the lit side in the light/dark test, a
protocol that has been pharmacologically validated with benzodiazepines, buspirone and
fluoxetine (Gebauer et al. 2011; Maximino et al. 2013a). NAC also clearly prevented
the anxiety-like behaviors induced by an acute stressor (net chasing).
NAC treatment failed to induce significant changes per se in the behavior of
zebrafish in the novel tank test. Vertical location in a novel environment has been
typically considered a parameter of anxiety in zebrafish, analogous to the thigmotaxic
behavior that rodents display in an open field (Levin et al., 2007). The main anxiolytic
class of benzodiazepines, however, does not increase the distance of fish from the tank
bottom, but reduce thigmotaxis in rodents (Choleris et al. 2001). In contrast, different
classes of antidepressants have been repeatedly shown to increase exploration of upper
zones when exposed to a novel tank without a previous stressor (Egan et al. 2009;
Sackerman et al. 2010; Gebauer et al. 2011). On the other hand, time spent in the lower
half increases when fish are exposed to threat, chronic unpredictable stress high-dose
caffeine and to alarm pheromone (Egan et al. 2009; Piato et al. 2011; Luca and Gerlai
2012). Taken together, these studies suggest that increased exploration of the upper
zone may be related to a more ‘elevated mood state’ or less anxiety, and staying in the
bottom zone may reflect avoidance, depressive-like or fear-related behavior. Thus, the
results showing no effect of NAC on fish behavior per se suggests that is does not have
an antidepressant or anxiolytic effect. This is in line with clinical data showing nonantidepressant effect of NAC in depressed patients (Berk et al, 2013), i.e., when they are
already depressed. However, NAC was effective in our study in preventing the
behavioral response to stressors, which may lead to depressive-like behavior in animals
and depression in humans. This suggests that NAC treatment may increase resilience to
stress and prevent new depressive episodes, rather than recovery from depression. Of
25 note, clinical observations of putative efficacy of NAC in nail biting (Berk et al. 2009;
Ghanizadeh et al. 2013), a typical behavior elicited by stress, are in line with this
proposal.
There are abnormal levels of glutamate and glutamate receptors in the brains of
patients with anxiety disorders (Bergink et al. 2004; Cortese and Phan 2005; Krystal et
al. 2010), and stressors increase synaptic glutamate levels in rodents (Popoli et al.
2011). NAC modulates glutamate by stimulating the inhibitory extra-synaptic
metabotropic receptors, a mechanism of action relevant when the glutamate tonus is
such that enough synaptic spill over is in place. Accordingly, considering that the
light/dark apparatus (with its limited dimensions and low water level) is more stressful
to fish than exploring a novel tank, the behavioral data presented here suggests that a
significant level of stress is required to reveal the effects of NAC. This is consistent
with the findings reported by Smaga et al. (2012), where NAC treatment only reduced
immobility time in the forced swimming test in olfactory bulbectomized but not in sham
rats. Overall, these data suggest that NAC may present an anti-stress effect, perhaps
with the potential to prevent stress-induced psychiatric disorders such as anxiety and
depression, and relapse in recovered patients – this possibility, however, awaits direct
testing in clinical trials designed to address these questions.
Recent studies have pointed to the direct involvement of oxidative stress in
anxiety-like behavior in rodents (Hovatta et al. 2005; Bouayed et al. 2007; Hassan et al.
2014). There are also data linking oxidative stress and certain anxiety disorders in
humans (Kuloglu et al. 2002; Bulut et al. 2013). As NAC increases glutathione levels
and act as a free radical scavenger, this may be an additional advantage considering the
role of oxidative metabolism in the regulation of anxiety. Despite these beneficial
effects, given the acute exposure to stress in our behavioral experiments, the antioxidant
effects of NAC are less likely to play a significant role.
Current drugs used in the treatment of anxiety disorders present limitations in
safety and efficacy, including sedation, tolerance, dependence, and withdrawal issues,
which justifies the pursuit of new medications with better therapeutic efficacy and
adverse effects profile. Several mGluR2/3 agonists present anxiolytic effects in rodent
models, and clinical trials are currently underway for these and other drugs that
26 modulate glutamate (Swanson et al. 2005). Among such newer drugs that target
glutamate, NAC has the advantage of being a low-cost alternative, devoid of serious
adverse effects and available as over-the-counter supplement (Whyte et al. 2007; Berk
et al. 2013; Samuni et al. 2013).
The zebrafish possesses significant genetic, endocrine and anatomic homology
with humans and rodents in relation to anxiety traits, and has been used as a model
organism in translational psychiatry research (Piato et al. 2011; Maximino et al. 2013b;
Kalueff et al. 2014a; Nguyen et al. 2014; Stewart et al. 2014). Unfortunately,
pharmacokinetic data is not available for the majority of drug studies in zebrafish,
which is a limitation of this study as well and merits further investigation. This
organism is sensitive to a wide range of anxiogenic and anxiolytic drugs, mostly in
agreement with rodent and clinical data for these agents (Kalueff et al. 2014b). This
significant correspondence in both physiology and drug response in reference to anxiety
invest the current data with translational validity for the further clinical trials needed to
substantiate the use of NAC in anxiety disorders.
Acknowledgments
This work was supported by Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico
e Tecnológico - Brazil (CNPq, Proc. 472715/2012-7). L.J.G.B. holds CNPq research
fellowship (CNPq, Proc. 302073/2011-6). The authors are grateful to Eduardo
Herrmann and Samuel Biron Rodrigues for their invaluable assistance with artwork
drawing and design.
27 References
Abreu MS de, Koakoski G, Ferreira D, Oliveira TA, Rosa JGS da, Gusso D, et al.
Diazepam and fluoxetine decrease the stress response in zebrafish. PloS One.
2014;9(7):e103232.
Ashburn TT, Thor KB. Drug repositioning: identifying and developing new uses for
existing drugs. Nat Rev Drug Discov. 2004 Aug;3(8):673–83.
Baker DA, Xi Z-X, Shen H, Swanson CJ, Kalivas PW. The origin and neuronal function
of in vivo nonsynaptic glutamate. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 2002 Oct
15;22(20):9134–41.
Bergink V, van Megen HJGM, Westenberg HGM. Glutamate and anxiety. Eur
Neuropsychopharmacol
J
Eur
Coll
Neuropsychopharmacol.
2004
May;14(3):175–83.
Berk M, Dean OM, Cotton SM, Jeavons S, Tanious M, Kohlmann K, et al. The efficacy
of adjunctive N-acetylcysteine in major depressive disorder: a double-blind,
randomized, placebo-controlled trial. J Clin Psychiatry. 2014 Jun;75(6):628–36.
Berk M, Jeavons S, Dean OM, Dodd S, Moss K, Gama CS, et al. Nail-biting stuff? The
effect of N-acetyl cysteine on nail-biting. CNS Spectr. 2009 Jul;14(7):357–60.
Berk M, Malhi GS, Gray LJ, Dean OM. The promise of N-acetylcysteine in
neuropsychiatry. Trends Pharmacol Sci. 2013 Mar;34(3):167–77.
Bloch MH, Panza KE, Grant JE, Pittenger C, Leckman JF. N-Acetylcysteine in the
treatment of pediatric trichotillomania: a randomized, double-blind, placebocontrolled add-on trial. J Am Acad Child Adolesc Psychiatry. 2013
Mar;52(3):231–40.
Bouayed J, Rammal H, Younos C, Soulimani R. Positive correlation between peripheral
blood granulocyte oxidative status and level of anxiety in mice. Eur J
Pharmacol. 2007 Jun 14;564(1-3):146–9.
Bulut M, Selek S, Bez Y, Karababa IF, Kaya MC, Gunes M, et al. Reduced PON1
enzymatic activity and increased lipid hydroperoxide levels that point out
oxidative stress in generalized anxiety disorder. J Affect Disord. 2013 Sep
25;150(3):829–33.
Choleris E, Thomas AW, Kavaliers M, Prato FS. A detailed ethological analysis of the
mouse open field test: effects of diazepam, chlordiazepoxide and an extremely
low frequency pulsed magnetic field. Neurosci Biobehav Rev. 2001
May;25(3):235–60.
Chrousos GP, Gold PW. The concepts of stress and stress system disorders. Overview
of physical and behavioral homeostasis. JAMA. 1992 Mar 4;267(9):1244–52.
28 Cortese BM, Phan KL. The role of glutamate in anxiety and related disorders. CNS
Spectr. 2005 Oct;10(10):820–30.
Dean O, Giorlando F, Berk M. N-acetylcysteine in psychiatry: current therapeutic
evidence and potential mechanisms of action. J Psychiatry Neurosci JPN. 2011a
Mar;36(2):78–86.
Dean OM, van den Buuse M, Berk M, Copolov DL, Mavros C, Bush AI. N-acetyl
cysteine restores brain glutathione loss in combined 2-cyclohexene-1-one and damphetamine-treated rats: relevance to schizophrenia and bipolar disorder.
Neurosci Lett. 2011b Jul 25;499(3):149–53.
Egan RJ, Bergner CL, Hart PC, Cachat JM, Canavello PR, Elegante MF, et al.
Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in
zebrafish. Behav Brain Res. 2009 Dec 14;205(1):38–44.
Egashira N, Shirakawa A, Abe M, Niki T, Mishima K, Iwasaki K, et al. N-acetyl-Lcysteine inhibits marble-burying behavior in mice. J Pharmacol Sci.
2012;119(1):97–101.
Gebauer DL, Pagnussat N, Piato AL, Schaefer IC, Bonan CD, Lara DR. Effects of
anxiolytics in zebrafish: similarities and differences between benzodiazepines,
buspirone and ethanol. Pharmacol Biochem Behav. 2011 Sep;99(3):480–6.
Ghanizadeh A, Derakhshan N, Berk M. N-acetylcysteine versus placebo for treating nail
biting, a double blind randomized placebo controlled clinical trial. Anti-Inflamm
Anti-Allergy Agents Med Chem. 2013;12(3):223–8.
Gold PW. The organization of the stress system and its dysregulation in depressive
illness. Mol Psychiatry. 2015 Feb;20(1):32–47.
Griebel G, Holmes A. 50 years of hurdles and hope in anxiolytic drug discovery. Nat
Rev Drug Discov. 2013 Sep;12(9):667–87.
Hassan W, Silva CEB, Mohammadzai IU, da Rocha JBT, J L-F. Association of
oxidative stress to the genesis of anxiety: implications for possible therapeutic
interventions. Curr Neuropharmacol. 2014 Mar;12(2):120–39.
Hovatta I, Tennant RS, Helton R, Marr RA, Singer O, Redwine JM, et al. Glyoxalase 1
and glutathione reductase 1 regulate anxiety in mice. Nature. 2005 Dec
1;438(7068):662–6.
Insel TR. Next-generation treatments for mental disorders. Sci Transl Med. 2012 Oct
10;4(155):155ps19.
Insel TR, Voon V, Nye JS, Brown VJ, Altevogt BM, Bullmore ET, et al. Innovative
solutions to novel drug development in mental health. Neurosci Biobehav Rev.
2013 Dec;37(10 Pt 1):2438–44.
29 Kalueff AV, Echevarria DJ, Stewart AM. Gaining translational momentum: More
zebrafish models for neuroscience research. Prog Neuropsychopharmacol Biol
Psychiatry. 2014a Mar 1;
Kalueff AV, Stewart AM, Gerlai R. Zebrafish as an emerging model for studying
complex brain disorders. Trends Pharmacol Sci. 2014b Feb;35(2):63–75.
Kessler RC, Chiu WT, Demler O, Merikangas KR, Walters EE. Prevalence, severity,
and comorbidity of 12-month DSM-IV disorders in the National Comorbidity
Survey Replication. Arch Gen Psychiatry. 2005 Jun;62(6):617–27.
Krystal JH, Mathew SJ, D’Souza DC, Garakani A, Gunduz-Bruce H, Charney DS.
Potential psychiatric applications of metabotropic glutamate receptor agonists
and antagonists. CNS Drugs. 2010 Aug;24(8):669–93.
Kuloglu M, Atmaca M, Tezcan E, Ustundag B, Bulut S. Antioxidant enzyme and
malondialdehyde levels in patients with panic disorder. Neuropsychobiology.
2002;46(4):186–9.
Lafleur DL, Pittenger C, Kelmendi B, Gardner T, Wasylink S, Malison RT, et al. Nacetylcysteine augmentation in serotonin reuptake inhibitor refractory obsessivecompulsive disorder. Psychopharmacology (Berl). 2006 Jan;184(2):254–6.
Luca RM, Gerlai R. Animated bird silhouette above the tank: acute alcohol diminishes
fear responses in zebrafish. Behav Brain Res. 2012 Apr 1;229(1):194–201.
Maximino C, Puty B, Benzecry R, Araújo J, Lima MG, de Jesus Oliveira Batista E, et
al. Role of serotonin in zebrafish (Danio rerio) anxiety: relationship with
serotonin levels and effect of buspirone, WAY 100635, SB 224289, fluoxetine
and para-chlorophenylalanine (pCPA) in two behavioral models.
Neuropharmacology. 2013a Aug;71:83–97.
Maximino C, Puty B, Benzecry R, Araújo J, Lima MG, de Jesus Oliveira Batista E, et
al. Role of serotonin in zebrafish (Danio rerio) anxiety: relationship with
serotonin levels and effect of buspirone, WAY 100635, SB 224289, fluoxetine
and para-chlorophenylalanine (pCPA) in two behavioral models.
Neuropharmacology. 2013b Aug;71:83–97.
McEwen BS. Physiology and neurobiology of stress and adaptation: central role of the
brain. Physiol Rev. 2007 Jul;87(3):873–904.
Moran MM, McFarland K, Melendez RI, Kalivas PW, Seamans JK. Cystine/glutamate
exchange regulates metabotropic glutamate receptor presynaptic inhibition of
excitatory transmission and vulnerability to cocaine seeking. J Neurosci Off J
Soc Neurosci. 2005 Jul 6;25(27):6389–93.
30 Nguyen M, Stewart AM, Kalueff AV. Aquatic blues: Modeling depression and
antidepressant action in zebrafish. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry.
2014 Mar 19;
Piato ÂL, Capiotti KM, Tamborski AR, Oses JP, Barcellos LJG, Bogo MR, et al.
Unpredictable chronic stress model in zebrafish (Danio rerio): behavioral and
physiological responses. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 2011
Mar 30;35(2):561–7.
Pitsikas N. The metabotropic glutamate receptors: potential drug targets for the
treatment of anxiety disorders? Eur J Pharmacol. 2014 Jan 15;723:181–4.
Popoli M, Yan Z, McEwen B, Sanacora G. The stressed synapse: the impact of stress
and glucocorticoids on glutamate transmission. Nat Rev Neurosci. 2011 Nov
30;13(1):22–37.
Riaza Bermudo-Soriano C, Perez-Rodriguez MM, Vaquero-Lorenzo C, Baca-Garcia E.
New perspectives in glutamate and anxiety. Pharmacol Biochem Behav. 2012
Feb;100(4):752–74.
Sackerman J, Donegan JJ, Cunningham CS, Nguyen NN, Lawless K, Long A, et al.
Zebrafish Behavior in Novel Environments: Effects of Acute Exposure to
Anxiolytic Compounds and Choice of Danio rerio Line. Int J Comp Psychol
ISCP Spons Int Soc Comp Psychol Univ Calabr. 2010 Jan 1;23(1):43–61.
Samuni Y, Goldstein S, Dean OM, Berk M. The chemistry and biological activities of
N-acetylcysteine. Biochim Biophys Acta. 2013 Aug;1830(8):4117–29.
Stewart AM, Braubach O, Spitsbergen J, Gerlai R, Kalueff AV. Zebrafish models for
translational neuroscience research: from tank to bedside. Trends Neurosci. 2014
May;37(5):264–78.
Whyte IM, Francis B, Dawson AH. Safety and efficacy of intravenous N-acetylcysteine
for acetaminophen overdose: analysis of the Hunter Area Toxicology Service
(HATS) database. Curr Med Res Opin. 2007 Oct;23(10):2359–68.
31 Figure captions
Figure 1. Schematic representation of the experimental protocol.
Figure 2. Effects of NAC (0.1, 1.0 and 10.0 mg/L) and FLU (10.0 mg/L) on total
distance traveled (A), number of crossings (B), maximum speed (C), time in the bottom
(D), time in the middle (E), and time in the upper zone of the tank (F) in the novel tank
test in zebrafish. The data are presented as the mean ± S.E.M. One-way ANOVA
followed by Tukey post hoc test. n=11-16. *p<0.01 Vs. control group.
Figure 3. Effects of NAC (0.1, 1.0 and 10.0 mg/L) and FLU (10.0 mg/L) on total
distance traveled (A), number of crossings (B), maximum speed (C), time in the bottom
(D), time in the middle (E), and time in the upper zone of the tank (F) in the acute stress
test in zebrafish. The data are presented as the mean ± S.E.M. Two-way ANOVA
followed by Tukey post hoc test. n=12. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 Vs. control
group; #p<0.05 Vs. stressed control group.
Figure 4. Effects of NAC (0.1, 1.0 and 10.0 mg/L) and BMZ (1.5 mg/L) on time in the
lit side of the tank (A), latency to first crossing (B) and number of crossings (C) in the
light/dark test. The data are presented as the mean ± S.E.M. One-way ANOVA
followed by Tukey post hoc test. n=10-19. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 Vs. control
group.
32 Figure 1:
33 Figure 2:
34 Figure 3:
35 Figure 4:
36 4
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados do presente estudo demonstram pela primeira vez que a NAC
possui propriedades anti-estresse e tipo-ansiolítica em peixes-zebra. Não houve
diferença significativa entre a NAC e controle em relação à distância total percorrida,
número de cruzamentos entre as diversas porções do aquário e velocidade máxima.
Dessa forma, a exposição à NAC não causa alterações motoras relevantes nos animais.
Nesse teste, animais expostos à fluoxetina apresentaram aumento no tempo de
permanência na porção superior do aquário. Esses dados já foram observados em
estudos anteriores com fluoxetina na concentração de 100 µg/L por duas semanas (Egan
et al., 2009).
O modelo de estresse agudo por perseguição foi capaz de diminuir a distância
total percorrida, o número de cruzamentos, o tempo de permanência na porção média e
o tempo de permanência na porção superior e, consequentemente, aumentar o tempo de
permanência na porção inferior do aparato. A partir desses resultados pode-se afirmar
que o protocolo foi ansiogênico para os animais. Entretanto, a exposição à NAC foi
capaz de prevenir todas essas alterações induzidas pelo estresse.
No teste de claro/escuro, NAC foi capaz de aumentar o tempo de permanência
no lado claro do aparato, com resultado comparável ao ansiolítico bromazepam. Além
disso, NAC diminuiu a latência para o primeiro cruzamento nas três concentrações
utilizadas no estudo.
Os resultados mostram que a NAC foi capaz de prevenir claramente o
comportamento ansiogênico induzido pelo protocolo de estresse agudo, podendo ser
interpretado como um efeito anti-estresse. Pode-se sugerir que a NAC possui um alto
potencial de prevenir ou atuar como um adjuvante no tratamento de transtornos
psiquiátricos que podem ser induzidas pelo estresse como ansiedade e depressão.
Contudo, mais estudos são necessários para justificar o uso da NAC em estresse e
transtornos psiquiátricos associados.
37 REFERÊNCIAS
Bailey, B., Blais, R., Letarte, A. Status epilepticus after a massive intravenous Nacetylcysteine overdose leading to intracranial hypertension and death. Ann.
Emerg. Med; 44 (2004) 401–406.
Baker, DA. Madayag A, Kristiansen LV, Meador-Woodruff JH, Haroutunian V, Raju I.
Contribution of cystine-glutamate antiporters to the psychotomimetic effects of
phencyclidine. Neuropsychopharmacology; 33 (2008) 1760-1772.
Barger, S.W., Basile, A.S. Activation of microglia by secreted amyloid precursor
protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synaptic
function. J. Neurochem. 76 (2001) 846-854
Bauzo, R.M., Kimmel, H.L., Howell, L.L. The cystine–glutamate transporter enhancer
N-acetyl-l-cysteine attenuates cocaine-induced changes in striatal dopamine but
not self-administration in squirrel monkeys. Pharmacol. Biochem. Behav; 101
(2012) 288–296.
Berk, M. Copolov DL, Dean O, Lu K, Jeavons S, Schapkaitz I, Anderson-Hunt M, Bush
AI. N-acetyl cysteine for depressive symptoms in bipolar disorder--a double-blind
randomized placebo-controlled trial. Biol Psychiatry; 64 (2008) 468–475.
Berk, M. Malhi GS, Gray LJ, Dean OM. . The promise of N-acetylcysteine in
neuropsychiatry. Trends in Pharmacological Sciences; 34 (2013) 167–177.
Bland, S.T., Hargrave, D., Pepin, J.L., Amat, J., Watkins, L.R. Stressor controllability
modulates stress-induced dopamine and serotonin efflux and morphine-induced
serotonin efflux in the medial prefrontal cortex. Neuropsy- chopharmacology; 28
(2003) 1589–1596. Bloom, D.E., Cafiero, E.T., Jané-Llopis, E., Abrahams-Gessel, S., Bloom, L.R.,
Fathima, S., Feigl, A.B., Gaziano, T., Mowafi, M., Pandya, A., Prettner, K.,
Rosenberg, L., Seligman, B., Stein, A.Z., & Weinstein, C. The Global Economic
Burden of Noncommunicable Diseases. Geneva: World Economic Forum 2011.
Chen, G., Shi, J., Hu, Z., Hang, C. Inhibitory effect on cerebral inflammatory response
following traumatic brain injury in rats: a potential neuroprotective mechanism of
n-acetylcysteine. Mediators Inflamm; (2008) 716458.
Costa-Campos, L., Herrmann, A.P., Pilz, L.K., Michels, M., Noetzold, G., Elisabetsky,
E. Interactive effects of N-acetylcysteine and antidepressants. Prog
Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry; 44 (2013) 125-130.
38 Crestani, F., Keist, R., Fritschy, J.M., Benke, D., Vogt, K., Prut, L., Blüthmann, H.,
Möhler, H., Rudolph, U. Trace fear conditioning involves hippocampal alpha5
GABA(A) receptors. Proc Natl Acad Sci U S A; 99 (2002) 8980-8985.
Crestani, F,. Löw, K., Keist, R., Mandelli, M., Möhler, H., Rudolph, U. Molecular
targets for the myorelaxant action of diazepam. Mol Pharmacol; 59 (2001) 442445.
Dean, O. Giorlando F, Berk M. N-acetylcysteine in psychiatry: current therapeutic
evidence and potential mechanisms of action. J Psychiatry Neurosci; 36 (2011a)
78-86.
Dean, O.M., Van den Buuse, M., Berk, M., Copolov, D.L., Mavros, C., Bush, A.I. Nacetyl cysteine restores brain glutathione loss in combined 2-cyclohexene-1-one
and d-amphetamine-treated rats: relevance to schizophrenia and bipolar disorder.
Neurosci Lett; 499 (2011b) 149–53.
Dean, O.M., Turner, A., Malhi, G.S., Ng, C., Cotton, S.M., Dodd, S., Sarris, J., Samuni,
Y., Tanious, M., Dowling, N., Waterdrinker, A., Smith, D., Berk, M. Design and
rationale of a 16-week adjunctive randomized placebo-controlled trial of
mitochondrial agents for the treatment of bipolar depression. Rev Bras Psiquiatr;
37 (2015) 3-12.
Deepmala, S.J., Kumar, N., Delhey, L., Berk, M., Dean, O., Spielholz, C., Frye, R.
Clinical trials of N-acetylcysteine in psychiatry and neurology: A systematic
review. Neurosci Biobehav Rev; (2015) pii: S0149-7634(15)00119-0
Deng, W., Wang, H., Rosenberg, P.A., Volpe, J.J., Jensen, F.E. Role of metabotropic
glutamate receptors in oligodendrocyte excitotoxicity and oxida- tive stress. Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A; 101 (2004) 7751–7756.
Devi, P.U., Pillai, K.K., Vohora, D. Facilitation action of N-acetylcysteine on the
anticonvulsant effect of sodium valproate in mice. Basic Clin Pharmacol Toxicol;
98 (2006) 521-2.
Diazgranados, N., Ibrahim, L., Brutsche, N.E., Newberg, A., Kronstein, P., Khalife, S.,
Kammerer, W.A., Quezado, Z., Luckenbaugh, D.A., Salvadore, G., MachadoVieira, R., Manji, H.K., Zarate, C.A. A randomized add-on trial of an N-methylD-aspartate antagonist in treatment-resistant bipolar depression. Arch Gen
Psychiatry; 67 (2010) 793-802.
Egan, R.J., Bergner, C.L., Hart, P.C., Cachat, J.M., Canavello, P.R., Elegante, M.F.,
Elkhayat, S.I., Bartels, B.K., Tien, A.K., Tien, D.H., Mohnot, S., Beeson, E.,
Glasgow, E., Amri, H., Zukowska, Z., Kalueff, A.V. Understanding behavioral
and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behav Brain Res;
205 (2009) 38-44.
39 Freitas-Ferrari MC, Hallak JE, Trzesniak C, Filho AS, Machado-de-Sousa JP, Chagas
MH. Neuroimaging in social anxiety disorder: a systematic review of the
literature. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 34 (2010) 565-80.
Fries, G.R., Kapczinski, F. N-acetylcysteine as a mitochondrial enhancer: a new class os
psychoative drugs? Revista Brasileira de Psiquiatria; 33 (2011) 321-322.
Goodman and Gilman. As bases farmacológicas da terapêutica. 12. ed. Porto Alegre:
AMGH editora Ltda, 2012.
Grant, JE. Odlaug BL, Kim SW. N-acetylcysteine, a glutamate modulator, in the
treatment of trichotillomania: a double-blind, placebo-controlled study. Arch Gen
Psychiatry; 66 (2009) 756-763.
Grant, J.E., Odlaug, B.L., Chamberlain, S.R., Potenza, M.N., Schreiber, L.R., Donahue,
C.B., Kim, S.W. A randomized, placebo-controlled trial of N-acetylcysteine plus
imaginal desensitization for nicotine-dependent pathological gamblers. J Clin
Psychiatry; 75 (2014) 39-45.
Hashimoto K. The role of glutamate on the action of antidepressants. Prog
Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry; 35 (2011) 1558-68.
Hetrick, S., Merry, S., McKenzie, J., Sindahl, P., Proctor, M. Selective serotonin
reuptake inhibitors (SSRIs) for depressive disorders in children and adolescents.
Cochrane Database Syst Rev; (2007): CD004851. Herrmann, A.P., Benvenutti, R., Pilz, L.K., Elisabetsky, E. N-acetylcysteine prevents
increased amphetamine sensitivity in social isolation-reared mice. Schizophr Res;
155 (2014) 109-111.
Holmes, A. Genetic variation in cortico-amygdala serotonin function and risk for stressrelated disease. Neurosci Biobehav Rev; 32 (2008) 1293–1314. Insel, T.R. Next-generation treatments for mental disorders. Sci Transl Med; (2012)
4(155):155ps19
Insel, T.R., Sahakian, B.J. Drug research: a plan for mental illness. Nature; (2012)
483(7389):269.
Insel, T.R., Voon, V., Nye, J.S., Brown, V.J., Altevogt, B.M., Bullmore, E.T., Goodwin,
G.M., Howard, R.J., Kupfer, D.J., Malloch, G., Marston, H.M., Nutt, D.J.,
Robbins, T.W., Stahl, S.M., Tricklebank, M.D., Williams, J.H., Sahakian, B.J.
Innovative solutions to novel drug development in mental health. Neurosci
Biobehav Rev; (2013) 37(10 Pt 1):2438-44.
Khan, M., Sekhon, B., Jatana, M., Giri, S., Gilg, A.G., Sekhon, C., Singh, I., Singh,
A.K., 1538 2004. Administration of N-acetylcysteine after focal cerebral ischemia
40 protects 1539 brain and reduces inflammation in a rat model of experimental
stroke. J. Neu- 1540 rosci. Res. 76 (2004) 519–527.
Katzung, B.G. Farmacologia básica e clínica. 12. ed. Porto Alegre: AMGH editor Ltda,
2014
Kessler RC, Demler O, Frank RG, Olfson M, Pincus HA, Walters EE, et al. Prevalence
and Treatment of Mental Disorders, 1990 to 2003. N Engl J Med; 352 (2005)
2515–2523.
Kessler, R. C. The global burden of anxiety and mood disorders: putting the European
Study of the Epidemiology of Mental Disorders (ESEMeD) findings into
perspective. J. Clin. Psychiatry; 68 (Suppl. 2) (2007) 10–19.
Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nat. Rev.
Drug Discov; 3 (2004) 711-715.
Krystal, J.H., Neumeister, A. Noradrenergic and serotonergic mechanisms in the
neurobiology of posttraumatic stress disorder and resilience. Brain Res; 1293
(2009) 13–23. Kupchik, Y.M., Moussawi, K., Tang, X.C., Wang, X., Kalivas, B.C., Kolokithas, R.,
Ogburn, K.B., Kalivas, P.W. The effect of N-acetylcysteine in the nucleus
accumbens on neurotransmission and relapse to cocaine. Biol. Psychiatry; 71
(2012) 978–986.
Lambe, E.K., Fillman, S.G., Webster, M.J., Shannon Weickert, C. Serotonin receptor
expression in human prefrontal cortex: balancing excitation and inhibition across
postnatal development. PLoS One; 6 (2011): e22799.
Lanzenberger, R.R., Mitterhauser, M., Spindelegger, C., Wadsak, W., Klein, N.
Reduced serotonin-1A receptor binding in social anxiety disorder. Biol
Psychiatry; 61 (2007) 1081–1089.
Lee, M.Y., Chiang, C.C., Chiu, H.Y., Chan, M.H., Chen, H.H. N-acetylcysteine
modulates hallucinogenic 5-HT(2A) receptor agonist-mediated responses:
behavioral, molecular, and electrophysiological studies. Neuropharmacology; 81
(2014) 215-23.
Linck, VM. Costa-Campos L, Pilz LK, Garcia CR, Elisabetsky E. AMPA glutamate
receptors mediate the antidepressant-like effects of N-acetylcysteine in the mouse
tail suspension test. Behav Pharmacol; 23 (2012) 171–177.
Liu, X.H., Xu, C.Y., Fan, G.H. Efficacy of N-acetylcysteine in preventing atrial
fibrillation after cardiac surgery: a meta-analysis of published randomized
controlled trials. BMC Cardiovasc Disord; (2014) 14:52.
41 Low, K., Crestani, F., Keist, R., Benke, D., Brünig, I., Benson, J.A., Fritschy, J.M.,
Rülicke, T., Bluethmann, H., Möhler, H., Rudolph, U. Molecular and neuronal
substrate for the selective attenuation of anxiety. Science; 290 (2000) 131-134.
Manual diagnóstico e estatístico de transtornos mentais: DSM-5. 5. ed. Porto Alegre:
Artmed, 2014.
Malhi, G.S., Berk, M., 2007. Does dopamine dysfunction drive depression? Acta
Psychiatr. Scand; 115 (2007) 116–124.
Martin, C.P., Talbert, R.L. Guia de farmacoterapia. 1. ed. Porto Alegre: AMGH editora
Ltda, 2015.
MEDSCAPE. Disponível em: http://www.medscape.com. Acesso em: 20 de Março de
2015.
Murrough, J.W., Iosifescu, D.V., Chang, L.C., Al Jurdi, R.K., Green, C.E., Perez, A.M.,
Iqbal, S., Pillemer, S., Foulkes, A., Shah, A., Charney, D.S., Mathew, S.J.
Antidepressant efficacy of ketamine in treatment-resistant major depression: a
two-site randomized controlled trial. Am J Psychiatry; 170 (2013) 1134-1142.
Ng, F., Berk, M., Dean, O., Bush, A.I. Oxidative stress in psychiatric disorders:
evidence base and therapeutic implications. Int J Neuropsychopharmacol; 11
(2008) 851-876.
Nikoo, M., Radnia, H., Farokhnia, M., Mohammadi, M.R., Akhondzadeh, S. Nacetylcysteine as an adjunctive therapy to risperidone for treatment of irritability
in autism: a randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial of
efficacy and safety. Clin Neuropharmacol; 38 (2015) 11-17.
Oja, S.S., Janáky, R., Varga, V., Saransaari, P. Modulation of glutamate receptor functions by glutathione. Neurochem; 37 (2000) 299–306.
Oliver, G., Dean, O., Camfield, D., Blair-West, S., Ng, C., Berk, M., Sarris, J. N-acetyl
cysteine in the treatment of obsessive compulsive and related disorders: a
systematic review. Clin Psychopharmacol Neurosci; 13 (2015) 12-24.
Olivier, J.D.A., Blom, T., Arentsen, T., Homberg, J.R. The age-dependent effects of
selective serotonin reuptake inhibitors in humans and rodents: A review. Prog
Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry; 35 (2010) 1400-1408.
Olsen, R.W., Sieghart, W. GABAA receptors: subtypes provide diversity of function
and pharmacology. Neuropharmacology; 56 (2009) 141–148.
Palmer, L.A., Doctor, A., Chhabra, P., Sheram, M.L., Laubach, V.E., Karlinsey, M.Z.,
Forbes, M.S., Macdonald, T., Gaston, B. S-nitrosothiols signal hypoxiamimetic
42 vascular pathology. J. Clin. Investig; 117 (2007) 2592–2601.
Prado, E., Maes, M., Piccoli, L.G., Baracat, M., Barbosa, D.S., Franco, O., Dodd, S.,
Berk, M., Vargas Nunes, S.O. N-acetylcysteine for therapy-resistant tobacco use
disorder: a pilot study. Redox Rep; (2015) Mar 2. [Epub ahead of print].
Piani, D., Fontana, A. Involvement of the cystine transport system xc- in the
macrophage-induced glutamate-dependent cytotoxicity to neurons. J. Immunol.
152 (1994) 3578-3585
Rudolph U, Knoflach F. Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential
of GABAA receptor subtypes. Nat Rev Drug Discov; 10 (2011) 685-97.
Sattler, R., Tymianski, M. Molecular mechanisms of glutamate receptor-mediated
excitotoxic neuronal cell death. Mol. Neurobiol. 24 (2001) 107-129.
Sos, P., Klirova, M., Novak, T., Kohutova, B., Horacek, J., Palenicek, T. Relationship
of ketamine's antidepressant and psychotomimetic effects in unipolar depression.
Neuro Endocrinol Lett; 34 (2013) 287-293.
Stein, M.B., Andrews, A.M. Serotonin States and Social Anxiety. JAMA Psychiatry.
(2015) doi: 10.1001/jamapsychiatry.2015.0486.
Tiihonen, J., Lehti, M., Aaltonen, M., Kivivuori, J., Kautiainen, H.J., Virta, L., Hoti, F.,
Tanskanen, A., Korhonen, P. Psychotropic drugs and homicide: A prospective
cohort study from Finland. World Psychiatry. 14 (2015) 245-247
Ulrich, D., Bettler, B. GABAB receptors: synaptic functions and mechanisms of
diversity. Curr. Opin. Neurobiol; 17 (2007) 298–303.
Walker, E.R., McGee, R.E., Druss, B.G. Mortality in Mental Disorders and Global
Disease Burden Implications: A Systematic Review and Meta-analysis. JAMA
Psychiatry; 72 (2015) 334-341.
Wang, X.F., Cynader, M.S. Astrocytes provide cysteine to neurons by releasing 1858
glutathione. J. Neurochem; 74 (2000) 1434–1442.
Weisstaub, N.V., Zhou, M., Lira, A., Lambe, E., Gonzalez-Maeso, J. Cortical 5-HT2A
receptor signaling modulates anxiety-like behaviors in mice. Science; 313 (2006)
536–540.
Whyte, I.M., Francis, B., Dawson, A.H. Safety and efficacy of intravenous Nacetylcysteine for acetaminophen overdose: analysis of the Hunter Area
Toxicology Service (HATS) database. Curr Med Res Opin; 23 (2007) 2359–68.
43 Wu, K. Hanna GL, Rosenberg DR, Arnold PD. The role of glutamate signaling in the
pathogenesis and treatment of obsessive-compulsive disorder. Pharmacol Biochem
Behav; 100 (2012) 726-735.
Zarate, CA, Singh JB, Carlson PJ, Brutsche NE, Ameli R, Luckenbaugh DA, Charney
DS, Manji HK. A randomized trial of an N-methyl-D-aspartate antagonist in
treatment-resistant major depression. Arch Gen Psychiatry; 63 (2006) 856-864.
Zarate, C.A., Brutsche, N., Laje, G., Luckenbaugh, D.A., Venkata, S.L., Ramamoorthy,
A., Moaddel, R., Wainer, I.W. Relationship of ketamine's plasma metabolites with
response, diagnosis, and side effects in major depression. Biol Psychiatry; 72
(2012) 331-338.
44 Carta de Aprovação da CEUA-Unochapecó