Download Document

Streszczenie pracy doktorskiej
mgr Tomasz Stępień
Tytuł pracy: Analiza morfologiczna komórek móżdżków pacjentów z rozpoznaniem choroby
Alzheimera.
Promotor: dr hab. Teresa Wierzba-Bobrowicz prof. nadzw. IPiN
Choroba Alzheimera należy do grupy neurozwyrodnieniowych chorób amyloidowych,
której zachorowalność wzrasta wraz z wiekiem i związana jest z upośledzeniem niektórych
szlaków metabolicznych. Główną przyczyną choroby wydaje się być zaburzony proces
degradacji określonych białek (-amyloid) i tworzenia toksycznych złogów, będących
jednocześnie markerami choroby. W czasie trwania choroby uszkodzeniu ulegają stopniowo
kolejne funkcje mózgu. Strukturami rekomendowanymi do oceny zmian chorobowych są
następujące struktury mózgu: kora nowa w płacie skroniowym, płacie ciemieniowym, korze
czołowej i potylicznej oraz śródmózgowie. W obrazie klinicznym odnajdujemy także cechy
móżdżkowego zespołu zaburzeń poznawczo-afektywnych. Wobec licznych objawów
klinicznych wskazujących na uszkodzenie móżdżku w chorobie Alzheimera, uzasadnione jest
wykonanie szczegółowej analizy morfologicznej jego elementów strukturalnych.
Celem pracy była analiza morfologiczna zmian neuropatologicznych komórek kory
móżdżków u pacjentów z rozpoznaniem choroby Alzheimera w mikroskopie świetlnym.
Ocena powstałych zmian ultrastrukturalnych komórek w różnych filogenetycznie regionach
kory móżdżku w mikroskopie elektronowym. Analiza ilościowa gęstości komórek Purkinjego
i komórek glejowych Bergmanna w móżdżkach pacjentów w grupie kontrolnej oraz grupie
badawczej.
Grupę badawczą z rozpoznaniem choroby Alzheimera stanowiły fragmenty
móżdżków, pochodzących od 13 pacjentów z rozpoznaniem choroby Alzheimera i czasem
trwania choroby nie dłuższym niż 10 lat. Grupę kontrolną tworzyły fragmenty móżdżków,
pochodzące od 15 pacjentów, u których nie stwierdzono choroby Alzheimera. Badania
przeprowadzono w trzech etapach. W pierwszym – analizowano komórki móżdżków w
mikroskopie świetlnym. Materiał doświadczalny, pochodzący od dwóch grup pacjentów
barwiono metodami histologicznymi i znakowano metodami immunohistochemicznymi. Jako
markerów neuronów użyto przeciwciał przeciwko neurofilamentom oraz białkom wiążącym
wapń: kalbindynie D28K, kalretyninie i parvalbuminie. Natomiast markerem dla komórek
astroglejowych było kwaśne włókienkowe białko glejowe (GFAP).
Uzyskane wyniki wskazują na brak różnic w reakcji immunohistochemicznej z
kalbindyną. Natomiast z kalretyniną zaobserwowano słabą reakcję immunohistochemiczną w
komórkach pędzelkowatych (unipolar brush cell) warstwy ziarnistej kory móżdżku w grupie
pacjentów z rozpoznaniem choroby Alzheimera. Także słabą reakcję immunohistochemiczną
zaobserwowano z parvalbuminą w komórkach koszyczkowych (basket cell) warstwy
drobinowej i komórkach Purkinjego warstwy zwojowej kory móżdżku w grupie badawczej.
W drugim etapie dokonano oceny zmian ultrastrukturalnych w mikroskopie
elektronowym. Materiał stanowiły fragmenty móżdżków z grupy badawczej i grupy
kontrolnej. Materiał pochodził z trzech różnych filogenetycznie okolic. Wycinek
neocerebellum
paleocerebellum
pobrano
z
pobrano z
płacika
półksiężycowego
płata
środkowego,
płacika czworokątnego płata przedniego,
wycinek
a wycinek
archicerebellum pobrano z grudki płata tylnego. W badaniu ultrastrukturalnym stwierdzono
zmiany patologiczne dotyczące głównie struktur błoniastych. W komórkach koszyczkowych
(basket cell), komórkach Purkinjego, komórkach Lugaro i komórkach Golgiego dużych,
obserwowano
uszkodzenie
mitochondriów
oraz
poszerzenie
kanałów
retikulum
endoplazmatycznego szorstkiego. Komórki Purkinjego wykazywały także zmiany w budowie
ciał lamelarnych, a w cytoplazmie obecne były struktury parakrystaliczne, zwane ciałami
Hirano. Ocenie ultrastrukturalnej poddano także komórki astrocytarne, w tym komórki
glejowe Bergmanna, zaangażowane w komunikację między komórkami Purkinjego.
Obrzękowi astrocytów towarzyszyło uszkodzenie mitochondriów, poszerzenie kanałów
retikulum endoplazmatycznego szorstkiego, fragmentacja gliofilamentów i obecność wiązek
osmofilnych gliofilamentów, zwanych włóknami Rosenthala. Komórki glejowe Bergmanna
wykazywały
uszkodzenie
mitochondriów
i
poszerzenie
kanałów
retikulum
endoplazmatycznego szorstkiego.
W trzecim etapie dokonano analizy ilościowej gęstości komórek Purkinjego i komórek
glejowych Bergmanna w korze móżdżku. Analizie poddano dwie grupy doświadczalne: grupę
kontrolną i grupę badawczą. Analizowany obszar obejmował powierzchnię 14,6 mm2
spadzistości (declive) powierzchni kory, lewej półkuli móżdżku, na wysokości jądra zębatego.
Wyniki analizowano w programie STATISTICA 9. W celu oddzielenia zmian powstałych na
skutek starzenia fizjologicznego od zmian chorobowych, pacjentów w obu grupach
podzielono na dwie grupy wiekowe, poniżej 80 roku życia (<80) i powyżej 80 roku życia
(≥80). Gęstość komórek Purkinjego, zarówno w grupie badawczej jak i kontrolnej poniżej 80
roku życia była większa, przy czym nieznacznie większą gęstość komórek Purkinjego
obserwowano w grupie badawczej. Większą gęstość komórek glejowych Bergmanna
obserwowano, poniżej 80 roku życia, w grupie badawczej, a także sumarycznie w zestawieniu
w grupą kontrolną. Przeprowadzono testy korelacji (test korelacji Spearmana i Pearsona), a
także analizę wariancji (test ANOVA) dla klasyfikacji jednoczynnikowej. Uzyskane różnice
nie wykazywały istotności statystycznej.
Nieznaczne osłabienie reakcji immunohistochemicznej z kalretyniną w komórkach
pędzelkowatych (unipolar brush cell) i parvalbuminą w komórkach Purkinjego oraz
koszyczkowych (basket cell), można tłumaczyć zaburzeniem w tych komórkach
wielopoziomowej regulacji gospodarki wapniowej. Przypuszczenia te potwierdzają wyniki
analizy ilościowej, które wskazują na zmniejszenie, po 80 roku życia, gęstości komórek
glejowych Bergmanna, pełniących między innymi ochronną rolę komórek Purkinjego,
których spadek gęstości również obserwowano. Badania ultrastrukturalne ujawniły zmiany
występujące w grupie badawczej, takie jak: włókna Rosenthala i ciała Hirano. Obraz
uszkodzeń ultrastrukturalnych komórek Purkinjego wskazywał na ich śmierć w mechanizmie
apoptozy i/lub aponekrozy. W neuronach i komórkach astroglejowych obserwowano rozległe
uszkodzenia mitochondriów, ze złogami wapnia w macierzy mitochondrialnej i poszerzenie
kanałów retikulum endoplazmatycznego szorstkiego. Zmiany te mogą być dowodem na
zachwianie równowagi osmotycznej komórki i zaburzenie gospodarki wapniowej. W oparciu
o dostępną literaturę oraz uzyskane w tej pracy wyniki można wnioskować o istotnym udziale
jonów wapnia w apoptozie w procesie uszkodzenia neuronów w chorobie Alzheimera.
Uzyskane w pracy wyniki wskazują na występowanie zmian morfologicznych w
móżdżkach w grupie badawczej, obecnych zarówno w neuronach jak i komórkach
astroglejowych
wszystkich
warstw
kory.
Wobec
licznych
objawów
klinicznych,
wskazujących na cechy móżdżkowego zespołu zaburzeń poznawczo-afektywnych, wyniki
powyższych badań sugerują uzupełnienie diagnostyki choroby Alzheimera o ocenę
neuropatologiczną kory móżdżku.
Abstract
Tomasz Stępień
Analysis of cerebellar cortex cells in Alzheimer disease.
Supervisor: dr hab. Teresa Wierzba-Bobrowicz prof. nadzw. IPiN
Alzheimer’s disease (AD) belongs to the group of neurodegenerative amyloid
diseases. AD is associated with the impairment of some metabolic pathways and its incidence
increases with age. A disturbed degradation process of certain proteins (β-amyloid) and the
production of toxic depositions are apparently the major causes of the disease. These
manifestations are also regarded as AD markers. In the course of the disease successive
functions of the brain undergo different forms of gradual damage. It is recommended to assess
the pathologic changes in the following cerebral structures: temporal and parietal lobes of the
neocortex, frontal and occipital cortex and mesencephalon. In the clinical picture, the traits of
cerebellar cognitive-affective syndrome are also revealed. In view of numerous clinical
symptoms, which indicate cerebral damage in Alzheimer’s disease, a thorough morphological
analysis of the brain structures seems to be greatly justified.
The aims of the present study were to perform a morphological analysis of
neuropathological lesions of cerebellar cells in the patients with Alzheimer’s disease
diagnosed on light microscopic examination; to assess the developed ultrastructural changes
in cells of different phylogenetic regions of the cerebellar cortex at the electron microscope;
and to perform the quantitative analysis of the density of Purkinje cells and Bergmann glial
cells in the patients’ cerebellum in the experimental and control groups.
The experimental group comprised cerebellar sections derived from 13 patients with
diagnosed Alzheimer’s disease lasting no longer that 10 years. The control group consisted of
cerebellar sections derived from 13 patients not affected by this disease. The study was
carried out at three stages. The first stage involved the light microscope analysis of cerebellar
cells. The study material obtained from two groups of patients was stained histological and
immunohistochemical techniques. I used antybodies against neurofilament and calbindinD28k, calretinine and parvalbumin (Calcium-Binding Protein) were used as neuron markers,
whereas glial fibrillary acidic protein antibody (GFAP) were applied as markers of astroglial
cells. The results of the study did not reveal differences in immunohistochemical reaction to
calbindin, but they disclosed weak reactions to calretinine in unipolar brush cells in the
granular layer and to parvalbumin in basket cells in the molecular layer and Purkinje cells
layer of the cerebellar cortex in AD-diagnosed patients. The assessment of ultrastructural
changes in the brain at the light microscope. The study material comprised cerebellar
fragments and three different phylogenetic regions derived from patients of the study and
control groups. The neocerebellum segment was derived from the middle lobe semilunar
lobule, the paleocerebellum segment from the anterior lobe quadrangular lobule, and the
archicerebellum segment from the posterior lobe nodulus. The ultrastructural analysis showed
pathologies mostly in the membranous structure. The mitochondria damage and enlargement
of the rough endoplasmic reticulum canals were observed in basket cells, Purkinje cells,
Lugaro cells and Golgi large cells. Purkinje cells also showed changes in the structure of
lamellar bodies, and paracrystal structures, termed “Hirano bodies”, were present in the
cytoplasm. Astrocyte cells, including Bergman glial cells, involved in the communication
between Purkinje cells were also subjected to ultrastructural assessment. Astrocyte cells,
icluding Bergmann glial cells, involved in the communication between Purkinje cells, aroused
our interest. Together with swelling of astrocytes, damage to mitochondria, enlargement of
the rough endoplasmic reticulum canals, fragmentation of gliofilaments and the presence of
osmophilic gliofilament fasciculi, termed “Rosenthal fibers”, were observed. Bergmann glial
cells showed the mitochondria damage and the enlargement of the rough endoplasmic
reticulum canals. No pathologies, characteristic of a specific phylogenetic structure, were
found.
The quantitative analysis of the density of Purkinje cells and Bergmann glial cells in
the cerebellar cortex. Both, the study and control groups, were analyzed. The area under study
covered 14.6 mm2 of the cortex declive of the left cerebellar hemisphere at the level of dentate
nucleus. The results were analyzed in the STATISTICA 9. The patients of both groups were
divided into age subgroups (< 80 and ≥ 80 years of age) to separate changes occurring due to
the physiological aging process from morbid pathologies. The density of Purkinje cells was
higher in the study and control subgroups of patients aged below 80 and only slightly higher
density of these cells was observed in the experimental group. A higher density of Bergmann
glial cells was observed in the patients aged below 80 in the study group and in their total
number compared with controls. Spearman and Pearson correlation tests, as well as one-way
analysis of variance (ANOVA) were performed. The results did not show statistical
significance.
Insignificantly weaker immunohistochemical reaction to calretinine in unipolar brush
cells, as well as to parvalbumin in Purkinje and basket cells could be explained by disorders
of multilevel regulation of calcium metabolism observed in those cells. These assumptions are
confirmed by the quantitative analysis that indicated the decreased density of Bergmann glial
cells in the patients aged over 80 years. These cells play among others a protective role in
Purkinje cells whose decrease was also observed. The ultrastructure examination revealed
changes in the study group, such as Rosenthal fibers and Hirano bodies. The ultrastructural
changes in Purkinje cells indicated their death in the mechanism of aponecrosis. In neurons
and astroglial cells, the extensive damage to the mitochondria with calcium depositions in the
mitochondrial matrix and rough endoplasmic reticulum. The aforesaid changes provide direct
evidence that the osmotic cell balance and calcium metabolism were disturbed. Based on the
available literature and the results of the reported study it may be concluded that calcium ions
are significantly involved in apoptosis during the process of neuron damage observed in
Alzheimer’s disease.
The reported results indicate the occurrence of morphological changes in cerebella of
the study group in both neurons and estroglial cells of all cortical layers. On account of
numerous clinical symptoms, showing the traits of cerebellar cognitive-affective syndrome,
the presented results suggest the need for adding the neuropathologic assessment to the
diagnosis of Alzheimer’s disease.