Download (in real time) as opposed to the endpoint detection Kvatitativní PCR

Real-Time PCR
Real-time PCR monitors the fluorescence emitted during
the reaction as an indicator of amplicon production at
each PCR cycle (in real time) as opposed to the endpoint
detection
Kvatitativní PCR v reálném čase
Tato technika je založena na použití fluorescenčně značených sond a detekčního
systému, který je schopen měřit intenzitu fluorescence. Intenzita fluorescence je tak
uměrná množství PCR produktu a pomocí kalibrační křivky sestrojené za použití známých
množství cílové DNA je možné přesně kvantifikovat množství cílové DNA v biologickém
vzorku.
Princip metody
Oligonukleotidová sonda označená dvěma fluorochromy nasedá na cílovou sekvenci uvnitř
amplifikovaného PCR produktu. Fluorochrom na 5´konci je označován jako reportér a fluorochrom
na 3´ konci jako zhášeč. Jestliže jsou oba fluochromy přítomny na jedné DNA molekule, nedochází
k žádnému vyzařování fluorescence. V okamžiku, kdy Taq polymerasa zahají další kolo syntézy,
dochází díky její exonukleasové aktivitě k degradaci sondy a reportérový fluorochrom je uvolněn ze
zhasnutého stavu. Intenzita fluorescence je monitorována kontiuálně během amplifikačního
procesu, vždy na konci jednotlivých cyklů. Intenzita fluorecence tedy přímo odpovídá množství PCR
produktu v reakci. PCR v reálném čase je poměrné nenáročná na provedení a je vysoce
reprodukovatelná. Další výhodou je možnost analyzovat velké množství vzorků najednou. Hlavním
limitem této metody zatím však zůstává vysoká pořizovací cena potředných zařízení V tomto
případě odpovídá fluorescence z uvolněných fluoroforů počtu dokončených kopií amplifikované
DNA. Toto uspořádání se označuje jako tzv. Taq Man analýza. Je nutné podotknout, že byla
vyvinuta řada dalších principů sledování intenzit fluorescence v průběhu PCR. Za zmínku stojí třeba
v současné době nejpokročilejší přístup s univezálními primery Amplifluor, které vytvářejí
intramolekulární vlásenku a jsou označeny na jednom konci fluoroforem a uprostřed před začátkem
prodloužení zhášečem. Tímto přístupem bylo dosaženo určitého zlevnění oproti předcházejícím
systémům, protože se nevyžaduje chemická syntéza pro každý případ nového, fluorescenčně
značeného primeru.
Real-time PCR advantages
* not influenced by non-specific amplification
* amplification can be monitored real-time
* no post-PCR processing of products
(high throughput, low contamination risk)
* ultra-rapid cycling (30 minutes to 2 hours)
* wider dynamic range of up to 1010-fold
* confirmation of specific amplification by melting point analysis
* most specific, sensitive and reproducible
* not much more expensive than conventional PCR
(except equipment cost)
Real-time PCR disadvantages
* not ideal for multiplexing
* setting up requires high technical skill and support
* high equipment cost
***
* intra- and inter-assay variation
* RNA lability
* DNA contamination (in mRNA analysis)
Real-time Principles
•based on the detection and quantitation of a fluorescent
reporter
Three general methods for the quantitative detection:
1. Hydrolysis probes (TaqMan, Beacons)
2. Hybridisation probes (Light Cycler)
3. DNA-binding agents (SYBR Green)
Principles of Real-Time Quantitative PCR techniques
(a) SYBR Green I technique: SYBR Green I fluorescence is enormously increased upon
binding to double-stranded DNA. During the extension phase, more and more SYBR
Green I will bind to the PCR product, resulting in an increased fluorescence.
Consequently, during each subsequent PCR cycle more fluorescence signal will be
detected.
(b) Hydrolysis probe technique: The hydrolysis probe is conjugated with a quencher
fluorochrome, which absorbs the fluorescence of the reporter fluorochrome as
long as the probe is intact. However, upon amplification of the target sequence,
the hydrolysis probe is displaced and subsequently hydrolyzed by the Taq
polymerase. This results in the separation of the reporter and quencher
fluorochrome and consequently the fluorescence of the reporter fluorochrome
becomes detectable. During each consecutive PCR cycle this fluorescence will
further increase because of the progressive and exponential accumulation of free
reporter fluorochromes.
(c) Hybridisation probes technique: In this technique one probe is labelled with a
donor fluorochrome at the 3’ end and a second –adjacent- probe is labelled with
an acceptor fluorochrome. When the two fluorochromes are in close vicinity (1–5
nucleotides apart), the emitted light of the donor fluorochrome will excite the
acceptor fluorochrome (FRET). This results in the emission of fluorescence, which
subsequently can be detected during the annealing phase and first part of the
extension phase of the PCR reaction. After each subsequent PCR cycle more
hybridisation probes can anneal, resulting in higher fluorescence signals.
(a) SYBR Green I technique: SYBR Green I
fluorescence is enormously increased upon
binding to double-stranded DNA. During the
extension phase, more and more SYBR Green I
will bind to the PCR product, resulting in an
increased fluorescence. Consequently, during
each subsequent PCR cycle more fluorescence
signal will be detected.
Hydrolysis probe technique: The hydrolysis probe is
conjugated with a quencher fluorochrome, which absorbs
the fluorescence of the reporter fluorochrome as long as
the probe is intact. However, upon amplification of the
target sequence, the hydrolysis probe is displaced and
subsequently hydrolyzed by the Taq polymerase. This
results in the separation of the reporter and quencher
fluorochrome and consequently the fluorescence of the
reporter fluorochrome becomes detectable. During each
consecutive PCR cycle this fluorescence will further
increase because of the progressive and exponential
accumulation of free reporter fluorochromes.
DNA Polymerase 5' exonuclease activity
Hybridisation probes technique: In this technique one probe
is labelled with a donor fluorochrome at the 3’ end and a
second –adjacent- probe is labelled with an acceptor
fluorochrome. When the two fluorochromes are in close
vicinity (1–5 nucleotides apart), the emitted light of the
donor fluorochrome will excite the acceptor fluorochrome
(FRET). This results in the emission of fluorescence,
which subsequently can be detected during the annealing
phase and first part of the extension phase of the PCR
reaction. After each subsequent PCR cycle more
hybridisation probes can anneal, resulting in higher
fluorescence signals.
What is CT?
The Amplification Plot contains valuable information for the quantitative measurement of DNA or
RNA. The Threshold line is the level of detection or the point at which a reaction reaches a
fluorescent intensity above background. The threshold line is set in the exponential phase of the
amplification for the most accurate reading. The cycle at which the sample reaches this level is
called the Cycle Threshold, CT. These two values are very important for data analysis using the 5’
nuclease assay.
(www)
Albumin (ALB) gene dosage by real-time PCR
Laurendeau et al. Clin Chem 1999 (www)
What is Rn?
+Rn
Sample
Rn
Rn
Threshold
No Template
Control
CT
0
10
-Rn
20
cycle number
30
40
Praktické uplatnění metody
Spektrum aplikací kvantitativní PCR v reálném čase je podobné jako pro
nekvantitativní techniky. Obrovskou výhodou je informace o kvantitě
detekovaného produktu. To je klíčové pro kvantifikaci fytopatogenního
organismu v analyzovaném vzorku. Znalost množství infekčního agens
dovoluje v dostatečném předstihu volit konkrétní přímé metody ochrany
rostlin nebo fytokaranténní opatření. Boyle et al. (2005) za použití kvantitivní
PCR v reálném čase studovali dynamiku růstu fytopatogenních hub rodu
Melampsora. Na základě kvantifikace DNA těchto fytopatogenů v jednotlivých
stádií růstu, od inokulace až po tvoru urédií, se jim podařilo sestrojit růstové
křivky pro jednotlivé druhy rodu Melapsora. Stejně tak byli úspěšní při
monitorování výskytu těchto hub před objevením prvních pozorovatelných
příznaků choroby, čímž byly potvrzeny i prakticky možnosti této techniky.
Jelikož
citlivost
této
techniky
mnohonásobně
převyšuje
klasické
imunochemické metody detekce rostlinných virů, jako je např. ELISA, má i
zde PCR v reálném čase své uplatnění. Schneider et al. (2004) vyvinuli a
optimalisovali metodu kvatitativní PCR detekce fytopatologicky významného
viru šárky švestky (angl. plum pox virus) v souvislosti s jeho nedávným
prvním výskytem v Kanadě.
LAMP Loop mediated isothermal amplification
“LAMP” which stands for Loop-mediated
Isothermal Amplification is a simple, rapid,
specific and cost-effective nucleic acid
amplification method solely developed by Eiken
Chemical Co., Ltd. It is characterized by the use
of 4 different primers specifically designed to
recognize 6 distinct regions on the target gene
and the reaction process proceeds at a constant
temperature using strand displacement reaction.
Amplification and detection of gene can be
completed in a single step, by incubating the
mixture of samples, primers, DNA polymerase
with strand displacement activity and substrates
at a constant temperature (about 65°C). It
provides high amplification efficiency, with DNA
being amplified 109-1010 times in 15-60 minutes.
Because of its high specificity, the presence of
amplified product can indicate the presence of
target gene.